河南省科技攻关计划(092102110073)
- 作品数：8 被引量：30H指数：4
- 相关作者：边传周郑鸣赵绪永马辉王永芬更多>>
- 相关机构：郑州牧业工程高等专科学校河南大学河南省科学院更多>>
- 发文基金：河南省科技攻关计划河南省教育厅自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学轻工技术与工程更多>>
- 建立环介导间接PCR同时检测3种主要猪源性病毒被引量：4
- 2011年
- 【目的】建立同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的环介导间接PCR方法,实现3种病毒快速检测。【方法】根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核苷酸序列设计3对特异性探针,利用PCR技术分别标记于大豆Lectin基因片段的两端形成3种不同的报告基因,此标记的报告基因与3种待测靶标基因经杂交、缺口补平、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立了PCV2、CSFV和PRRSV的环介导间接PCR检测方法,扩增片段大小分别为564 bp、434 bp和338 bp,该方法即可用于单病毒检测又可用于多病毒检测。【结果】灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单病毒检测还是多病毒检测,该法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒同时检测的底限分别为0.8、25和6.2 pg.μL-1,和单个病毒的检测灵敏度相同。利用环介导间接PCR和常规PCR对20份临床样本进行比较检测,结果表明,无论单病毒检测还是多病毒检测,其结果均与常规PCR检测结果完全一致。【结论】环介导间接PCR检测技术可用于PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒的同时检测,是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具。
- 郑鸣边传周王老七
- 关键词：猪圆环病毒2型猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒
- 环介导间接PCR检测方法的建立被引量：3
- 2012年
- 建立环介导间接PCR检测体系,为分子诊断提供一种新的检测工具。以质粒pUC18的核苷酸序列为模板,设计两条特异性探针,采用常规PCR技术将特异性探针标记于大豆Lectin基因的左右两端充当报告基因,此标记的报告基因与待检的pUC18质粒经杂交和缺口补平后形成一环状DNA分子,然后采用反向PCR技术扩增报告基因,建立针对pUC18质粒的环介导间接PCR检测方法。结果表明,该检测方法的检测底限为0.32 pg/μL,与常规PCR相当,并且与其他质粒和动物DNA检测无交叉反应,是一种简单、快速、灵敏、特异的PCR检测方法。
- 王永芬郑鸣边传周
- 关键词：探针报告基因分子诊断
- 环介导间接PCR鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒方法的建立被引量：7
- 2013年
- 建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)环介导间接PCR检测方法,用于该病毒的感染检测和高致病性毒株与低致病性毒株的鉴别诊断。根据GenBank数据库中PRRSV中国流行株ORF7和ORF1a基因序列的保守性,设计2对特异性探针,分别标记于大豆Lectin基因两端,作为报告基因,经过一步链置换反应后,采用反向PCR扩增报告基因,建立PRRSV环介导间接PCR检测方法,该方法扩增HP-PRRSV可得大小为193bp和355bp的特异片段,扩增LP-PRRSV可得大小为193bp和442bp的特异片段。试验结果表明,该方法能成功鉴别HP/LP-PRRSV,可检测出5.6TCID50/mL LP-PRRSV和18TCID50/mL HP-PRRSV的病毒RNA,HP/LP-PRRSV混合感染不影响检测灵敏度,与CSFV、PPV、PRV、PCV2、ETEC和Haemophilus parasui等常见猪源性病原的检测无明显交叉反应;对20份临床样本进行比较检测,环介导间接PCR检测出14份PRRSV阳性样本,其中4份LP-PRRSV、9份HP-PRRSV和1份LP/HP-PRRSV,与常规PCR检测结果一致。环介导间接PCR是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具,适合PRRSV感染的快速检测和HP/LP-PRRSV鉴别诊断,尤其适合HP/LP-PRRSV混合感染的鉴别。
- 郑鸣李华玮边传周王永芬王老七
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒报告基因
- 鹅副黏病毒L基因片段的克隆及其主要抗原表位区的原核表达
- 2013年
- 利用PCR扩增鹅副黏病毒编码L蛋白的主要抗原表位区基因片段,并将该片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,通过诱导表达条件的摸索,实现了L蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中的高效中的表达,SDS-PAGE检测表达的融合蛋白主要以可溶形式存在,Western blot分析重组蛋白具有良好的抗原性,并利用亲和层析得到融合蛋白。
- 马辉边传周赵绪永郑宝亮郑鸣
- 关键词：鹅副黏病毒原核表达
- 猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA方法的建立被引量：2
- 2012年
- 以猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA建立为目的,以猪细小病毒基因组DNA为模板,扩增获得PPVNS1主要抗原表位基因,将其插入到真核表达载体pPICZα-A中,获得重组质粒pPICZα-A-NS1。电转化后将重组毕赤酵母菌株诱导表达,SDS-PAGE检测证实重组蛋白获得了高效表达,Western blot实验表明表达产物具有良好的反应原性。将纯化后的重组蛋白包被酶标板,经棋盘法优化,初步建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最佳包被浓度为1.9μg/mL,血清最佳稀释度为1∶80,阳性判断标准定为OD待检血清>0.4且OD待检血清/OD标准阴性值>2.0。用该方法对猪血清样品进行检测,结果显示本方法与HI试验的符合率达91.2%,与国外同类试剂盒的符合率为92.1%,该间接ELISA方法特异性强、敏感性高,可用于猪细小病毒病感染抗体的检测。
- 马辉赵绪永边传周
- 关键词：猪细小病毒NS1基因真核表达间接ELISA
- 猪主要繁殖障碍疾病病原的多重实时定量PCR快速检测被引量：1
- 2012年
- 本研究旨在建立多重Real-time PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)。根据GenBank数据库中PRRSV、PCV2、PRV、和PPV的核苷酸序列设计特异性引物和探针,通过优化反应条件,检测系列稀释的纯化阳性质粒,建立检测PRRSV、PCV2、PRV和PPV的单项和多重Real-time PCR方法。灵敏度和特异性试验结果表明,无论是单项和多重Real-timePCR检测,该方法都具有高度特异性,与其它病原检测无明显交叉反应;对4种病毒的最低检测量为<101拷贝或1TCID50,检测灵敏度比常规PCR高100倍。对40份临床样本进行检测,多重Real-time PCR检测结果和单项Real-time PCR检测结果完全一致。建立的同时检测PRRSV、PCV2、PRV和PPV的多重Real-time PCR方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能对样品进行定量检测等优点。
- 赵绪永赵丽宁豫昌马辉
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型猪伪狂犬病毒猪细小病毒
- Chelex法结合环介导间接聚合酶链式反应检测肉制品单增李斯特菌被引量：6
- 2012年
- 目的:建立肉制品中单增李斯特菌环介导间接聚合酶链式反应检测体系,实现快速检测。方法:采用Chelex法从肉制品中分离模板DNA,根据单增李斯特菌hlyA基因的保守区设计两条探针,将探针标记于报告基因(大豆Lectin基因)的两端,此标记的报告基因与待测靶基因经杂交、缺口补平、环化后,采用反向聚合酶链式反应扩增报告基因,实现对靶基因的检测。结果:该检测体系检出限低于100CFU/g(mL),且与其他食源性致病菌的检测无明显交叉反应,对200份肉制品进行检测,阳性率为2.5%,与传统细菌分离检测结果完全相符。结论:环介导间接聚合酶链式反应可以快速、灵敏、特异检测肉制品中单增李斯特菌污染。
- 郑鸣边传周刘仲敏
- 关键词：肉制品单增李斯特菌
- 牛传染性鼻气管炎病毒gC蛋白单克隆抗体的制备与初步应用被引量：14
- 2013年
- 为制备牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gC蛋白的特异性单克隆抗体,并分析其免疫学特性,以原核表达并纯化的重组gC蛋白为免疫原注射免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。建立间接ELISA方法筛选分泌gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,获得1株能稳定分泌gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3D6。3D6的亚类为IgG1型,轻链为κ链;上清、腹水抗体效价分别为6.4×103、1.28×105;Western blot和间接免疫荧光试验表明该单克隆抗体能识别牛gC蛋白。利用3D6细胞株分泌的单克隆抗体建立了检测IBRV的双抗体夹心ELISA方法,结果证明,该方法特异性和敏感性良好,为快速诊断IBRV和研究gC蛋白功能奠定了基础。
- 马辉边传周王永芬王鲜萍郑宝亮赵绪永
- 关键词：牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体ELISA
