国家高技术研究发展计划(2006AA10A207-1)
- 作品数：9 被引量：20H指数：3
- 相关作者：赵其平黄兵韩红玉姜连连董辉更多>>
- 相关机构：中国农业科学院上海兽医研究所新疆农业大学山东师范大学更多>>
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- 柔嫩艾美耳球虫表面抗原(EtSAG)基因的分离及鉴定被引量：1
- 2010年
- 利用本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊和未孢子化卵囊差异表达ESTs序列,选取编号为BW4-C03的孢子化卵囊,采用RACE技术,获得该基因全长序列。经BLAST分析,该序列与柔嫩艾美耳球虫表面抗原有72%以上的同源性,命名为EtSAG。利用荧光定量PCR(Real-time PCR)检测发现该基因在孢子化卵囊的转录拷贝数最高,且随着孢子化时间的延长,转录拷贝数逐渐增加。采用原核表达载体pET-28C表达该基因,得到的融合蛋白大小约为36 kDa,符合预期大小。经Western blot分析,该重组蛋白可被兔抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。本研究结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。
- 马卫娇韩红玉姜连连董辉赵其平朱顺海程军曾艳波黄兵
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫表面抗原克隆表达抗原性分析
- 柔嫩艾美耳球虫子孢子高表达新基因的克隆、表达及分析被引量：3
- 2010年
- 为克隆和研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)新基因,本研究在所获得的ESTs序列的基础上,应用RACE技术克隆获得了1个在子孢子阶段高表达新基因的全长cDNA序列(GU553107),命名为ZB7-C11,该基因全长1439bp,ORF为525bp,编码174个氨基酸,预测表达蛋白的分子量约为18.7ku。Real-timePCR对E.tenella不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)表达量进行分析显示,该基因在子孢子阶段的表达高于其它阶段。另外,将ZB7-C11克隆于pGEX-4T中构建重组质粒pGEX-4T-C11,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达6h后其表达量最高,并且重组蛋白分子量约44.7ku大部分以可溶性存在。Westernblot分析显示该重组蛋白可被抗E.tenella的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。该结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。
- 李洋韩红玉董辉赵其平姜连连朱顺海郭涛平宪卿马卫娇曾艳波程军黄兵
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫子孢子克隆
- 堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子的克隆和表达被引量：3
- 2008年
- 本研究扩增和克隆了堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子,并在大肠杆菌中表达出MIF重组蛋白。根据GenBank中的MIF mRNA序列,设计特异引物,采用PCR方法以堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库为模板扩增获得MIF基因,将MIF基因片段连接到原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET28a-MIF,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,对表达产物进行Western blot分析。结果从堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库中扩增出MIF基因片段,长度为709bp;经序列分析,扩增片段的核苷酸序列与GenBank中登录的MIF序列的同源性为99.5%;经SDS-PAGE检测表明重组质粒pET(28a)-MIF在大肠杆菌中以包涵体形式表达;Western blot分析证明堆形艾美耳球虫抗血清可与重组表达蛋白特异性结合。本研究结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。
- 阎晓菲韩红玉黄兵岳城赵其平姜连连董辉卞庆松张建哲
- 关键词：球虫堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子克隆
- 同位素微量试验法检测新化合物抗恶性疟原虫活性试验
- 同位素微量试验法是 WHO 推荐的评估抗疟活性和检测抗疟药敏感性的方法,国内报道甚少。采用同位素微量试验法检测20个新化合物对恶性疟原虫 Dd2、3D7克隆系的抗疟活性,结果显示,20个新化合物均没有明显的抗疟原虫活性;...
- 陈兆国Alicia MorenoAgustin BenitoMarta MorenoPedro J.BerzosaAida de LucioEva Moyano胡坛仿
- 关键词：恶性疟原虫抗疟药
- 文献传递
- 柔嫩艾美耳球虫HSP基因的克隆、表达及鉴定被引量：3
- 2009年
- 为研究柔嫩艾美耳球虫热激蛋白(Heat shock proteins,HSPs)的生物学特性,应用RACE和RT-PCR技术,从柔嫩艾美耳球虫子孢子中首次克隆获得了EtHSP的全长cDNA(GenBank Accession No.FJ911605)。EtHSP包含一个1455 bp的开放阅读框,编码484个氨基酸,预测表达蛋白的分子量大小为53.5 kD。应用Real-time PCR对柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)表达量进行分析,发现该基因在子孢子阶段的表达明显高于其他阶段。同时,构建了原核表达重组质粒pET28a(+)-EtHSP,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果显示,重组质粒pET28a(+)-EtHSP在大肠杆菌中以包涵体形式表达,经1 mmol/L IPTG诱导6 h后的表达量最高,该蛋白可被抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。本研究结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。
- 颜彦韩红玉黄兵赵其平董辉姜连连李玉剑樊玉娟姚倩
- 关键词：柔嫩艾美球虫热激蛋白发育阶段免疫原性
- 堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建及鉴定被引量：4
- 2007年
- 构建堆形艾美耳球虫（Eimeria acervulina）孢子化卵囊cDNA表达文库,以筛选其功能性基因.用TRI-ZOL Reagent试剂提取堆形艾美耳球虫总RNA,再用Oligo（dT）12-纤维素柱从总RNA中分离mRNA,以mRNA为模板,RT-PCR法反转录合成cDNA第一链,用LD-PCR法扩增合成双链cDNA,经蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切、CHROMA SPIN-400柱分离去除小于400 bp的片段后,将cDNA与已经SfiⅠ酶切的λTriplEx2载体按一定比例连接,经体外包装,建立堆形艾美耳球虫孢子化卵囊的噬菌体表达文库.随后测定文库容量为4.6×10^6pfu/mL,扩增文库的滴度为4.4×10^10pfu/mL,重组率达到98%,插入片段大小为750-1 000 bp,并从扩增文库中扩增出了堆形艾美耳球虫巨噬细胞游走抑制因子基因片段.
- 闫晓菲韩红玉岳城黄兵赵其平姜连连董辉卞庆松张建哲
- 关键词：球虫堆形艾美耳球虫孢子化卵囊CDNA文库
- 应用发酵罐高密度生产日本血吸虫重组蛋白Sj28GST工艺的研究被引量：1
- 2009年
- 为了大量表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST,本文采用葡萄糖作为碳源,在不同的培养温度、种子液接种量I、PTG浓度I、PTG诱导时间等培养条件下进行高密度发酵表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST,分别用Bradford法和比浊法分析重组蛋白Sj28GST的浓度和重组大肠杆菌的密度。优化应用发酵罐高密度发酵表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST的培养温度、种子液接种量I、PTG浓度I、PTG诱导时机等培养条件。研究结果表明,在培养温度37℃、种子液接种量7%、溶解氧浓度保持20%以上、pH7.2左右、用0.7mmol/L IPTG在重组大肠杆菌TB1开始培养后5h进行诱导,细菌密度明显提高,获得的重组蛋白Sj28GST的表达产量最高,为74.32mg/L发酵液,菌体密度达到13OD左右。
- 沈阳林矫矫姚利晓刘金明
- 关键词：高密度发酵
- 柔嫩艾美耳球虫A08基因的阶段表达分析与毕赤酵母表达系统构建被引量：2
- 2011年
- 对A08蛋白基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)的转录情况进行分析,同时以A08蛋白cDNA为模板扩增出1 083 bp的目的基因片段,将该基因连接到pGEM-T-easy载体上,经序列测定和双酶切鉴定表明为A08基因.用EcoRI和NotI酶切回收目的片段连接至用同样酶切的真核表达载体pPIC9k上,构建了重组质粒pPIC9k-A08,转化大肠杆菌TOP10后,提取质粒,经酶切鉴定正确后用SacI将重组质粒线性化,再电转入毕赤酵母GS115菌株,G418筛选抗性重组子,经PCR鉴定正确重组子后做甲醇诱导表达.RT-PCR结果显示该基因在子孢子阶段的转录拷贝数显著高于其他发育阶段,是一个子孢子高表达基因.重组酵母诱导表达产物经SDS-PAGE检测证实,柔嫩艾美耳球虫A08基因在毕赤酵母中获得表达.Western-blot初步分析表明,表达产物具有免疫学反应活性.
- 平宪卿韩红玉黄兵姜连连董辉赵其平李洋郭涛朱顺海
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫荧光实时定量PCR毕赤酵母
- 微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15基因的克隆及核苷酸序列分析被引量：7
- 2007年
- 目的对编码微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)子孢子表面抗原CP15基因进行克隆和序列分析,并对其编码的氨基酸变异情况进行分析。方法对田间分离的鼠、兔、猪源微小隐孢子虫提取总RNA,经RT-PCR扩增CP15基因,克隆到pMD 18-T载体中,鉴定正确后进行序列测定,并与GenBank上下载的序列进行同源性比对。结果克隆的CP15基因核苷酸序列与GenBank登录的核苷酸序列比较,鼠源微小隐孢子虫同源性为99.23%,兔源微小隐孢子虫为97.96%,猪源微小隐孢子虫为98.72%,氨基酸序列同源性分别为100%、97.7%和98.4%。结论获得微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15基因,不同宿主来源的CP15基因序列高度一致,为利用该基因进行免疫预防和诊断研究奠定了基础。
- 米荣升陈兆国岳城于慧珠薛方民于咏兰林矫矫
- 关键词：微小隐孢子虫克隆
- 一种柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白单抗的制备及初步应用被引量：3
- 2010年
- 利用原核表达的柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白(EtRP)的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA和Western blot筛选获得一株抗EtRP蛋白的特异性单克隆抗体细胞株,命名为2E3,亚类鉴定为IgG2a。细胞上清和小鼠腹水的效价分别为1∶40和1∶2.56×104。利用该单抗对EtRP在柔嫩艾美耳球虫子孢子中的分布进行分子定位,结果显示该蛋白主要分布于子孢子的顶端;而当子孢子在DMEM培养基中41℃孵育1 h后,该蛋白则分布于整个虫体。研究结果表明,成功制备了EtRP单克隆抗体,为进一步研究球虫相关蛋白功能奠定了基础。
- 平宪卿韩红玉姜连连赵其平董辉黄兵岳城李洋郭涛朱顺海
- 关键词：柔嫩艾美耳球虫单克隆抗体分子定位
