河南省科技攻关计划(092102110102)
- 作品数：5 被引量：8H指数：2
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- 自我延伸过程对木聚糖酶-CBM融合基因的影响
- 2013年
- 探讨了木聚糖酶-纤维素结构结合结构域(CBM)基因融合过程,在不加引物而只用两种DNA片段经PCR扩增全长融合基因,从而证明了自我延伸过程的存在,是指互补匹配的两段DNA互为引物、互为模板在聚合酶作用下合成融合基因的过程,从理论上阐明了PCR中的自我延伸过程。在传统PCR中加入3次循环的自我延伸程序(94℃×1 min,52℃×1 min,72℃×1 min),融合基因扩增量要更多。进而探讨自我延伸程序中延伸时间的影响,发现延伸时间2、3、5 min扩增的融合基因量显著增强;而延伸时间为1 min时,融合基因条带的亮度增加不明显,说明延伸时间是增加扩增量的关键因素。
- 闫鹏飞马闪闪赵黎胡瑜刘亮伟
- 关键词：融合PCR融合基因
- 木聚糖酶碳水化合物结合结构域研究进展被引量：6
- 2010年
- 木聚糖酶含有催化活性结构域,有时还含有非催化活性结构域,促进酶与底物结合,特别是与不溶性底物的结合及降解,称为碳水化合物结合结构域(CBM),它们在木聚糖降解过程中有重要作用。以下从CBM来源,所属家族类型、对不溶性底物结合特性、与底物结合的特定氨基酸、与催化结构域间的连接肽、特别是对影响木聚糖酶稳定性的5个方面进行了综述,说明CBM对木聚糖酶性质有很大影响。自然界中碳水化合物结构复杂、难以降解,所以认识CBM相关性质对研究其与木聚糖酶的协同作用、提高木聚糖酶活性有重要意义,并根据CBM属性用于改造木聚糖酶相关性质进行了展望。
- 刘亮伟程洁陈红歌
- 关键词：木聚糖酶稳定性
- 含正确木聚糖酶基因转化子的活性筛选被引量：1
- 2010年
- 为有效地筛选到带有正确基因的转化子,探讨了活性筛选方法。将木聚糖酶基因与pET20b重组,转化BL21(DE3)大肠杆菌,选取转化子,放入0.5mLLB培养基过夜培养,补加9.5mL培养基2.5h后诱导,收集并冻融裂解细胞,检测酶活性。通过对10个转化子的筛选,其中7个转化子酶活性接近或高于阳性对照菌落,认定为阳性转化子,经DNA测序证明基因序列正确。这个过程只要2～3天,具有快速简便特点。与以往筛选方法中针对转化子中的基因不同,作者直接检测转化子酶活性,筛掉不能表达活性酶的突变基因;其次,用冻融裂解细胞方法简化裂解过程,便于自动化高通量操作;最后,通过比较初筛酶活性,可以筛选高酶活转化子。
- 刘亮伟李运峰郭晓丹
- 关键词：转化子活性检测木聚糖酶
- 合成引物碱基缺失造成木聚糖酶的移码突变
- 2010年
- 黑曲霉木聚糖酶xynⅢ酶分子改造时,常出现引物碱基缺失造成扩增基因移码突变.本研究将xynⅢ克隆入表达载体pET20b,分析移码突变酶C-端氨基酸序列,探讨了该碱基缺失突变的检测方法.引物中缺失1或2 bp碱基时,扩增基因产生2种移码突变酶,分别在正常酶分子C-端增加30或12个氨基酸,比正常酶分子质量分别增加6或2 ku;而缺失3 bp碱基时不产生移码突变,只比正常酶分子少1个氨基酸,含有6个H is标签;通过SDS-PAGE可将移码突变酶与正常酶分子分开,从而将移码突变基因与正常基因分开,这个理论与DNA测序结果完全吻合.同时发现2 bp碱基缺失突变是1 bp碱基缺失突变的2倍,分析了其产生原因.最后,提出了避免引物中碱基缺失移码突变发生的预防措施.
- 刘亮伟卢雪丽胡瑜李运锋
- 关键词：木聚糖酶引物移码突变
- 载体大小对木聚糖酶过量表达的影响被引量：2
- 2010年
- 将黑曲霉Aspergillus niger木聚糖酶基因与表达载体pET21a(5 443 bp)和pET20b(3 716 bp)重组,而后转化E.coliBL21(DE3)细胞,发现大载体细胞和小载体细胞中质粒DNA浓度为(4.6±0.01),(5.5±0.01)g.L-1,木聚糖酶含量为(57.2±10.6),(140.2±22.1)mg.L-1,木聚糖酶酶活性为(6.6±0.2),(69.6±11.2)U.mL-1.相对于大载体细胞,小载体细胞质粒浓度增加19.5%,木聚糖酶含量增加1.45倍,木聚糖酶活性增加9.5倍,说明载体大小对外源蛋白表达的影响效应呈递增趋势.由此可见,小型载体在表达外源蛋白时更利于减少宿主细胞的负担,利于质粒扩增并提高基因拷贝数,最后提高木聚糖酶含量及活性.
- 刘亮伟郭晓丹王宝
