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CHO-hm_1R工程细胞株的建立及乙酰胆碱对其细胞内钙离子浓度的影响被引量：3: 2004年; 目的　获得表达人毒蕈碱样乙酰胆碱Ⅰ型受体(hm1 R)的工程细胞株 (CHO hm1 R)并鉴定表达受体是否具有相应的功能活性。方法　以健康人基因组DNA为模板 ,PCR扩增hm1 R之cDNA ,并构建pcDNA3 .1 (+) hm1 R表达载体 ,转染CHO K1 细胞获得CHO hm1 R工程细胞株 ,将不同浓度的乙酰胆碱作用于细胞 ,以Fura 2为荧光探针检测细胞内钙离子浓度变化 ;同时 ,观察阿托品预处理对乙酰胆碱作用的影响。结果　成功得到CHO hm1 R工程细胞株 ;乙酰胆碱 1 0 ,1 0 0 μmol·L-1 均可增高细胞内钙离子浓度 ,此反应可被阿托品 50 0 μmol·L-1 完全阻断。结论　CHO hm1 R工程细胞株可以用于hm1 R配基的检测。; 余少平熊永炎王琼贺艳丽伍仕敏高月高沛永刘永学; 关键词：乙酰胆碱钙离子浓度细胞

孤儿G蛋白偶联受体hGPCRc的亚细胞定位及组织分布被引量：5: 2005年; 利用相关生物信息学软件,对从人结肠组织克隆所得某一孤儿G蛋白偶联受体(orphanGprotein_coupledreceptors ,oGPCRs)成员hGPCRc的氨基酸序列进行分析显示,hGPCRc对应的氨基酸序列组成了七个跨膜区段的结构域,具备GPCR的结构特征;然后,将hGPCRc之cDNA与绿色荧光载体pEGFP_N1 构建GFP_hGPCRc表达载体,以空白质粒pEGFP_N1 作对照,转染CHO_K1 细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下观察到空白质粒pEGFP_N1 转染的细胞表达了GFP并均匀分布于整个细胞,而GFP_hGPCRc转染的细胞观察到荧光清晰聚集于细胞膜和各细胞器质膜上,因而hGPCRc蛋白定位于膜上并稳定表达,与软件分析结果相一致;最后,以RT_PCR检测hGPCRc在2 0周龄胎儿重要组织器官及部分成人组织中的表达情况,结果显示hGPCRc在人心、肾、小脑及结肠等组织均有表达,但在肝、大脑、小肠及肌肉等组织里未检测到表达。该表达谱对于进一步认识hGPCRc在胚胎发育中的作用及生理功能提供了线索。; 袁广胜潘光堂吴芳明韩春光黄火高胡明盛莉陈静刘永学

人GPR81-Gi1α融合蛋白在杆状病毒系统中的表达及优化被引量：1: 2008年; 旨在建立获得融合蛋白GPR81-Gi1α的方法和最优条件。采用RT-PCR从人胚胎肾及大脑组织总RNA中分别扩增孤儿G蛋白偶联受体GPR81和Gi1α的完整表达序列(分别为1 041bp和1 065bp),并构建各自的重组质粒pcDNA3.1(+)-GPR81及pcDNA3.1(+)-Gi1α,再以重组质粒为模板,运用重叠延伸PCR法扩增得到融合基因GPR81-Gi1α,测序无误后将融合基因与pFASTBac1重组得重组质粒pFASTBac1-GPR81-Gi1α,而后转化DH10Bac,使该融合基因重组质粒发生特异性的转座和病毒重组,获得杆状病毒表达穿梭质粒pBacmid-GPR81- Ci1α,再将该重组杆粒转染昆虫sf9细胞,获得含杆状病毒的细胞分泌上清,以上清在不同条件下(包括不同感染时间、滴度等)感染sf9细胞以优化融合蛋白在昆虫sf9细胞的表达条件。结果表明,感染72h且感染强度moi为5时是融合蛋白在sf9细胞中高效表达的理想条件。该表达体系的建立及蛋白表达条件的优化,保证了足量GPR81- Gi1α融合蛋白的制备。; 吴芳明韩春光彭明丽黄琳仪王琼朱欣凯刘永学; 关键词：融合蛋白

人源孤儿G蛋白偶联受体hGPCRc的分子克隆及其初步鉴定被引量：8: 2005年; 孤儿G蛋白偶联受体 (orphanGprotein coupledreceptors ,oGPCRs)是最重要的潜在药物靶点 ,对于创新药物研究意义重大 .根据已有文献及相关基因数据库提供的信息 ,利用RT PCR从人结肠组织获得oGPCR某一成员的氨基酸编码序列 ,大小为 10 14bp ,而且与GenBank已登录序列(AB0 835 98)完全一致 ,称之为hGPCRc ;又用相同的引物以健康志愿者血液基因组DNA作为模板进行PCR扩增 ,亦得到同样大小的DNA序列 ,测序显示二者个别碱基不一致 ,但所对应氨基酸序列并无差异 .另外 ,RT PCR对人源部分组织及细胞系的检测结果显示 :hGPCRc在人脑组织表达最高 ,结肠次之 ,其它组织或细胞系如胃、血液、肝、肺、上皮未检测到该基因的表达 .利用相关软件对hGPCRc分别结果显示 :hGPCRc定位于人染色体 13q32 3,与小鼠、大鼠的对应物序列同源性高达85 % ,但与人源其他已知基因的同源性较低 ,对应的氨基酸序列组成了 7个跨膜区段的结构域 .因此 ,hGPCRc符合GPCR的结构特点 ,应为人类oGPCRs的新成员 .; 袁广胜余少平潘光堂刘永学; 关键词：孤儿G蛋白偶联受体靶点

GPCR-Gα融合蛋白及其在oGPCRs配基筛选中的应用被引量：1: 2005年; GPCRGα融合蛋白是近几年用于受体研究的新颖手段之一,它的表达确保了受体与G蛋白之间1∶1的化学计量关系、空间位置上的邻近性及适宜于高通量的配基筛选,使其为孤儿G蛋白偶联受体提供了一种新的研究策略,将在孤儿受体的配基筛选中发挥重要作用,对研发以oGPCR为作用靶点的新药产生积极意义。; 吴芳明刘永学; 关键词：孤儿G蛋白偶联受体 G蛋白融合蛋白

人源受体hGPCRc工程细胞株的建立及其应用被引量：2: 2005年; 目的建立孤儿G蛋白偶联受体(OrphanGproteincoupledreceptors,oGPCRs)配基筛选体系并应用于化合物的筛选。方法利用RTPCR从人结肠组织获得oGPCR成员hGPCRc的氨基酸编码序列,在利用相关软件对hGPCRc的结构特点进行分析的基础上,构建hGPCRc之表达载体pcDNA3.1(+)hGPCRc,转染CHOK1细胞获得CHOhGPCR工程细胞株,将不同化合物作用于细胞株,用Fluo3为分子探针检测细胞内钙离子浓度变化,以分析化合物中是否为该受体的特异性配基。结果生物信息学分析得到:hGPCR定位于人染色体13q32.2,对应的氨基酸序列组成了7个跨膜区段的结构域,在进化树上与人源P2Y1受体最亲近,应属于人类GPCR成员;成功得到CHOhGPCRc工程细胞株;所检测化合物作用于细胞株并没有引起胞内钙离子的波动,很可能没有活化hGPCRc。结论hGPCRc是一个与已知人P2Y1最近的成员,但基于CHOhGPCRc工程细胞株的第二信使筛选结果表明,hGPCRc并不被P2Y1的已知配基活化因此很可能属于不同于P2Y1的嘌呤类受体新亚型。; 袁广胜刘永学; 关键词：孤儿G蛋白偶联受体工程细胞株

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