山东省自然科学基金(Z2003C03)
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
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- 相关机构：山东大学山东省立医院同济大学附属口腔医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 质粒表达载体pIRES-CD的构建及其在ACC-2细胞中的表达
- 2008年
- 目的:克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因,构建质粒表达载体pIRES-CD,并利用该载体转染ACC-2细胞,建立稳定表达大肠杆菌CD基因的ACC-2细胞克隆。方法:通过PCR从大肠杆菌DH5αDNA中扩增出CD基因全长序列,将扩增产物定向插入到克隆载体pMD18-T中,进行序列测定。测序正确后,将其亚克隆到质粒表达载体pIRES中,构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的CD基因的质粒表达载体pIRES-CD,采用电穿孔法,以质粒表达载体转染ACC-2细胞,用400μg/mL的G418筛选10d,获得稳定表达CD基因的ACC-2细胞系,提取该细胞的总RNA,用RT-PCR检测CD基因的表达。结果:PCR扩增出1280bp大小的片段,测序结果与GeneBank报道的CD序列基本一致;阳性重组质粒pIRES-CD经XbaI和NotI双酶切后,获得6.1kb和1280bp的片段;RT-PCR从转染细胞的总RNA中扩增出228bp的预期片段。结论:成功扩增了CD基因的DNA片段;成功构建了质粒表达载体pIRES-CD;建立了稳定表达CD基因的ACC-2细胞系,为CD/5-FC自杀基因系统在腺样囊性癌基因治疗中的应用奠定了基础。
- 黄圣运张东升张世周刘桂军牟文丽张捷
- 关键词：自杀基因胞嘧啶脱氨酶基因内部核糖体进入位点核酸内切酶
- TK基因重组质粒的构建及在ACC-2细胞中的表达
- 2008年
- 目的:克隆胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因,构建质粒表达载体pIRES-TK,并利用该载体转染ACC-2细胞,建立了稳定表达TK基因的ACC-2细胞克隆。方法:通过PCR从逆转录病毒重组体pLNSX-TK中扩增出TK基因全长序列,将扩增产物定向插入到克隆载体pMD18-T中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆到质粒表达载体pIRES中,构建重组表达载体pIRES-TK,用电穿孔法以该质粒转染ACC-2细胞,经G418筛选获得稳定表达TK基因的ACC-2细胞株,提取该细胞株的总RNA,用RT-PCR检测TK基因的表达。结果:PCR扩增出1128bp大小的片段,测序结果与GeneBank报道的TK序列基本一致;阳性重组质粒pIRES-TK经XhoI和MulI双酶切后获得2692Bb和1128bp的片段;RT-PCR从转染细胞的总RNA中扩增出361bp的预期片段。结论:成功扩增了TK基因的DNA片段;成功构建了质粒表达载体pIRES-TK;建立了稳定表达TK基因的ACC-2细胞株,为TK/GCV自杀基因系统在腺样囊性癌基因治疗中的应用奠定良好的基础。
- 黄圣运张东升刘桂军牟文丽张世周张捷
- 关键词：胸腺嘧啶核苷激酶自杀基因核酸内切酶腺样囊性癌
- 重组表达载体pIRES-CD、pIRES-TK的构建及其在ACC-2细胞中的表达被引量：1
- 2007年
- 目的:运用分子生物学技术扩增CD、TK基因,进行其DNA序列分析,并构建真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK,将其共同转染ACC-2细胞,为进一步研究双自杀基因对ACC-2细胞杀伤作用奠定基础。方法:根据CD和TK基因DNA的序列分别设计、合成引物,构建克隆载体pMD18-T-CD和pMD18-T-TK,并进行DNA序列分析;构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的CD和TK基因的真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK,用电穿孔法以真核表达质粒共同转染ACC-2细胞,用RT-PCR检测CD和TK的表达。结果:克隆DNA片段和GeneBank上报道的CD、TK序列基本一致,且经酶切鉴定,CD、TK基因成功插入真核表达质粒IRES,RT-PCR检测表明,以真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK共同转染的ACC-2细胞能表达CD和TK。结论:成功扩增了CD、TK的DNA片段,并进行了序列分析;成功构建CD和TK基因的重组真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK,将其转染ACC-2细胞后能分泌性表达CD和TK,为肿瘤基因治疗的研究提供一定途径。
- 黄圣运张东升张世周刘桂军赵跃然王来成刘义庆
- 关键词：胞嘧啶脱氨酶基因胸腺嘧啶核苷激酶内部核糖体进入位点核酸内切酶
