国家自然科学基金(31172332)
- 作品数：6 被引量：19H指数：2
- 相关作者：李雪松李国新李泽君肖亚莉闫丽萍更多>>
- 相关机构：中国农业科学院上海兽医研究所内蒙古农业大学济南大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金公益性行业(农业)科研专项上海市科技兴农重点攻关项目更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 坦布苏病毒MM1775株反向遗传操作系统的建立
- 2015年
- 本研究将坦布苏病毒MM1775株全基因组分3段克隆,获得3个重组质粒,利用融合PCR方法扩增得到5'端含有T 7启动子的病毒全长c DNA,经体外转录得到感染性的RNA,将RNA转染DF-1细胞,48 h后出现细胞病变。当细胞病变达到90%,将细胞上清接种DF-1细胞,72 h后进行间接免疫荧光(indirect immunofulorescence,IFA)和RT-PCR鉴定,结果表明拯救病毒成功。序列测定结果显示,拯救毒的全基因组序列与亲本毒完全一致,表明MM1775反向遗传操作系统构建成功,为进一步研究坦布苏病毒致病性等相关分子机制奠定了基础。
- 闫大为吴晓刚李雪松石迎冯琳琳崔宏锐李国新李泽君
- 密码子优化的鸭坦布苏病毒E基因在昆虫细胞中的表达被引量：1
- 2013年
- 为了使鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)的E蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统中高效表达,本研究将DTMUV的E基因按照昆虫细胞偏嗜性密码子进行了优化,合成了基因optiE,并将其插入到pFastBac HT载体上,得到质粒pFastBac-optiE。将该质粒转化DH10BAC感受态细胞,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组转座子rBacmid-optiE。将rBacmid-optiE转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,间接免疫荧光试验和Western blot方法都证实目的蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得了表达。本研究为进一步研究DTMUV E蛋白的结构与功能奠定了基础。
- 肖亚莉刘建龙李雪松余磊滕巧泱闫丽萍李国新李泽君
- 关键词：E蛋白密码子优化
- 鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量PCR方法的优化被引量：8
- 2013年
- 为提高鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan荧光定量PCR方法的敏感性和简化反应条件,本研究在前期建立的TaqMan荧光定量PCR方法的基础上,设计一条特异性的反转录引物,优化反应体系,建立了简便、快速、敏感的TaqMan荧光定量PCR方法。该荧光定量PCR方法最低检测限为10拷贝,敏感性是未优化的荧光定量PCR方法的5倍、是普通PCR方法的100倍,并且该方法对DTMUV的最低检测限是0.01半数鸡胚致死量(ELD50)。通过批内和批间实验的变异系数表明优化的荧光定量PCR方法的重复性比未优化的荧光定量PCR方法好。通过该优化的荧光定量PCR方法检测其它常见的鸭病病毒的DNAs或RNAs,证明了该方法特异性好。对现地60份疑似DTMUV的样品进行检测,用该方法检出57份样品为阳性,明显高于普通PCR,并且在区分35Ct值左右样品试验中敏感性优于未优化的荧光定量PCR方法。该优化的DTMUV TaqMan荧光定量PCR方法更适用于DTMUV的快速定量流行病学诊断。
- 彭珊闫丽萍李国新李雪松滕巧泱肖亚莉何文兴李泽君
- 关键词：荧光定量PCR
- 鸭坦布苏病毒E蛋白中和性单克隆杭体的制备被引量：9
- 2012年
- 本试验利用纯化的鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus , DTMUV)奉贤株(FX2010)免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,筛选获得3株能够稳定分泌杭DTMUV的杂交瘤细胞,分别命名为:J1-E5-E4, 7B5和1E5-B6,3株杂交瘤细胞诱导同品系刁、鼠的杭体效价为1:12 800,1:6 400和1:25 600。间接ELISA和IFA结果显示,3株单杭均可以与DTMUV发生特异性反应。进一步研究发现,J1-E5-E4可以与DTMUV-E蛋白结合,使得表达E蛋白的293T细胞显现出特异性的绿色荧光;在病毒中和试验中,J1-E5-E4可以中和DTMUV,使其失去致死鸡胚的能力。这些结果表明,J1-E5-E4是一株针对DTMUV-E蛋白中和表位的单杭,该单杭将在DTMUV诊断和杭原分析中发挥重要作用。
- 姬希文李雪松李国新肖亚莉颜丕熙徐大伟范钊张七斤李泽君
- 关键词：E蛋白单克隆抗体
- 密码子优化对鸭坦布苏病毒E基因DNA疫苗免疫应答的增强作用
- 2012年
- 为提高DNA疫苗用于预防鸭坦布苏病毒病的免疫原性,将鸭坦布苏病毒的E基因密码子改造为鸭偏嗜的密码子,并将其作为免疫原基因克隆到pCAGGS载体中,构建真核表达质粒pCAGGS-OptiE。将pCAGGS-OptiE和先前构建的编码野生型E基因的表达质粒pCAGGS-E分别转染293T细胞,用间接免疫荧光和Western-blot检测E蛋白的表达情况。结果显示,密码子优化的重组质粒的蛋白表达量明显高于野生型质粒。将重组质粒pCAGGS-OptiE和pCAGGS-E用脂质体包裹后分别尾静脉注射免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA检测抗体的产生情况。结果显示,质粒pCAGGS-OptiE诱导的抗体水平明显高于pCAGGS-E,表明密码子优化的E基因能够提高蛋白的表达水平,进而增强机体免疫应答反应。
- 徐大伟李国新李雪松李云章李泽君
- 关键词：DNA疫苗E基因密码子优化
- 不同代次鸭坦布苏病毒对蛋鸭的致病力研究被引量：1
- 2014年
- 为探讨鸭坦布苏病毒奉贤分离株(FX2010)在鸡胚成纤维细胞上传代培养对病毒致病力的影响,采用FX2010及其第100代(FX2010-100P)和180代(FX2010-180P)传代培养的病毒肌肉注射接种6月龄蛋鸭,观察接种鸭的临床表现、病理变化以及病毒在鸭体内的分布,评价不同代次病毒对蛋鸭的致病力。结果显示,FX2010感染鸭发病非常明显,各脏器均有明显病理变化,FX2010-100P感染鸭表现较轻的临床发病症状和病理变化,而FX2010-180P感染鸭未表现临床发病症状和病理变化;FX2010组在大部分鸭的脾、肺、肾、脑和卵巢中都能分离到病毒,而FX2010-100P组仅在少部分鸭的脾、肺、肾和卵巢中能分离到病毒,在脑中分离不到病毒,FX2010-180P组仅在少部分鸭的脾中分离到病毒。研究表明传代毒对鸭的致病力逐渐降低,其毒力的降低可能与病毒在体内增殖能力下降相关。
- 石迎高旭元余磊李雪松闫丽萍滕巧泱刘思当李国新李泽君
- 关键词：传代致病力
