中山大学中山医学院病原生物学部
- 作品数：30 被引量：135H指数：8
- 相关作者：彭寨玉徐进唐希美更多>>
- 相关机构：山西医科大学基础医学院广东药学院基础学院解放军军需大学动物科技系更多>>
- 发文基金：广东省自然科学基金国家自然科学基金广州市科技攻关项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 华支睾吸虫乙醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析被引量：2
- 2005年
- 【目的】通过筛选华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库,发现并识别新基因,将发现的新基因编码区克隆到原核表达质粒pGEX鄄4T鄄1并表达出融合蛋白。【方法】用文库通用引物对华支睾吸虫cDNA质粒文库进行PCR扩增,对产物为500bp以上的质粒测序,结果在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析,并应用ORFfind、ClustalW、NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行开放阅读框(ORF)、进化树及结构域分析。根据载体多克隆位点及新基因ORF设计引物,PCR扩增,产物克隆到目的载体上。筛选并鉴定出阳性克隆,对鉴定过的重组体进行诱导表达,表达产物经SDS鄄PAGE电泳鉴定。【结果】发现CsALDH基因,完整阅读框含1467个碱基,编码489个氨基酸,理论相对分子质量Mr≈52.564×103,理论pI为5.43。序列分析表明,CsALDH基因编码的氨基酸序列与其它物种有较高的同源性,CsALDH与爪蛙属乙醛脱氢酶的同源性为59%,具有乙醛脱氢酶保守功能域。构建的重组原核表达质粒经鉴定与目标基因相符。电泳显示表达产物在Mr≈78×103处有一条特异性条带。【结论】发现华支睾吸虫磷酸甘油醛脱氢酶基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。
- 吴德吴忠道徐进何东苟余新炳
- 关键词：华支睾吸虫分子克隆原核表达
- P43基因在造血干细胞移植患者弓形虫感染诊断中的应用
- 2003年
- 目的建立快速、特异、敏感诊断造血干细胞移植(HSCT)患者弓形虫感染情况的DNA检测方法,并讨论其临床意义。方法利用ELISA和PCR方法对56例造血干细胞移植受者及20例正常供者同时进行检测。结果检测造血干细胞移植受者56例,PCR和ELISA方法检测弓形虫P43基因片段和其抗原,阳性各为10及7例;其阳性率分别为17.86％和14.3％。作为阴性对照的20名正常者同时进行弓形虫的检测,其结果均为阴性。结论体外扩增弓形虫P43基因的方法具有准确、快速、特异和敏感的优点,可以作为造血干细胞移植患者弓形虫感染诊断的有价值的方法之一。
- 周永安余新炳徐劲郑焕钦吴忠道陈观今乔振华
- 关键词：造血干细胞移植弓形虫感染
- 人源性抗腮腺炎病毒噬菌体抗体库的构建被引量：2
- 2003年
- 应用噬菌体表面呈现技术,从腮腺炎病毒抗体阳性者淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增出抗体重链Fd和轻链基因,经XhoI/SpeI、SacI/XbaI双酶切,先后克隆入噬粒载体pComb3中,再电转化大肠杆菌XL1-blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染。从分离出的淋巴细胞中共提取高质量RNA约110μg,经逆转录、PCR,分别扩增出约700 bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接,在2.5 kV、200 Ω、25μF的条件下电转化,转化率为2.48×107。最终得到库容量为6.4×106,滴度为7.8×1013 cfu/L的噬菌体抗体库。所构建的抗腮腺炎病毒特异性噬菌体抗体库容量中等大小,能满足从中筛选抗HN蛋白噬菌体抗体的需要。
- 俞慕华曾忠铭段永翔黄锐敏叶友松雷智刚詹希美
- 关键词：腮腺炎病毒逆转录聚合酶链反应电穿孔噬菌体抗体
- 恙虫病东方体Karp株Sta56基因的克隆及序列比较的研究被引量：1
- 2003年
- 目的扩增恙虫病东方体Karp株主要表膜抗原Sta56的开放读码框(ORF)全长,并进行序列比较研究。方法小鼠接种传代和体外细胞扩增分离恙虫病东方体Karp株,用PCR方法扩增恙虫病东方体Karp株Sta56基因,并采用TA克隆技术构建测序载体,对测序结果进行同源性分析比较。结果 扩增出Sta56的ORF全长,并TA克隆到测序载体pMD18-T vector,测序结果与Karp标准株的同源性为99.4％。结论 Sta56全长ORF克隆扩增成功,为进一步构建表达载体,进行Sta56蛋白表达研究提供基础。
- 赖延东郑小英黄炯烈詹希美
- 关键词：恙虫病东方体克隆
- 肺炎链球菌R6株全基因组序列的初步分析被引量：2
- 2003年
- 袁竹青吴忠道
- 关键词：肺炎链球菌全基因组序列生物学转运蛋白
- 华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析被引量：10
- 2005年
- 目的 通过筛选华支睾吸虫成虫 cDNA质粒文库,寻找、识别新基因,并将其编码区克隆到原核表达质粒pGEX 4T 1中,表达出融合蛋白,为进一步研究其功能奠定基础。 方法 用文库通用引物对华支睾吸虫 cDNA 质粒文库进行PCR扩增,对产物为500 bp以上的质粒进行测序,测序结果在NCBI 和ExPasy 网站上进行序列分析,识别华支睾吸虫新基因,并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行开放阅读框、进化树及结构域分析。根据 pGEX 4T 1上的多克隆位点及所发现的新基因cDNA 编码序列设计引物,进行PCR 扩增,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体 pGEX 4T 1 上。构建的重组表达质粒经 PCR、双酶切及测序鉴定,并对鉴定过的重组体进行诱导表达,表达产物经SDS PAGE电泳鉴定。 结果 发现CsGAPDH基因,完整阅读框含1 017 个碱基对,编码339 个氨基酸,理论分子质量单位为37.024 09 ku ,理论pI为6.66 。序列分析显示,CsGAPDH与曼氏血吸虫GAPDH的同源性为78%,具有GAPDH保守功能域。所构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符。SDS PAGE电泳显示表达产物在63 ku处有1条特异性条带。 结论 发现华支睾吸虫 GAPDH基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。
- 吴德吴忠道胡旭初何东苟黄艳余新炳
- 关键词：华支睾吸虫克隆原核表达
- 华支睾吸虫3-磷酸甘油酸激酶基因的扩增、克隆及表达被引量：5
- 2004年
- 目的 构建编码华支睾吸虫 3 磷酸甘油酸激酶基因的原核表达载体 ,并分析其在大肠埃希菌中的表达。 方法 用Trizol法从华支睾吸虫 3 成虫体内提取总RNA ,并将其反转录成cDNA。根据华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶的已知基因 ,利用DNAclub和PCRdesign软件设计合成一对特异引物 ,从合成的cDNA中 ,用PCR技术扩增出目的片段。将目的片段和原核表达载体同时双酶切后连接 ,重组体转入JM10 9大肠埃希菌 ,用双酶切、PCR和测序筛选阳性克隆。挑选 1个阳性菌落 ,用异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达 ,表达产物进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)鉴定。 结果 用逆转录 聚合酶链反应技术扩增出 1条 12 48bp大小的片段 ,PCR产物测序鉴定正确 ;转化后得到 10个克隆 ,双酶切、PCR扩增鉴定 ,其中 6个为阳性克隆 ;表达产物用SDS PAGE鉴定 ,在相对分子质量 70 0 0 0处有 1条与理论预测的融合蛋白大小相一致的特异条带。 结论 成功构建重组原核表达载体pGEX 4T 1 PGK 。
- 吴德余新炳徐劲吴忠道陈守义何东苟
- 关键词：华支睾吸虫原核表达载体扩增酶基因阳性克隆
- 恶性疟原虫海南株端粒酶催化亚基基因的克隆及序列分析被引量：1
- 2003年
- 目的 克隆恶性疟原虫端粒酶基因 ,为今后筛选抗疟药物提供理论依据。方法 根据四膜虫的端粒酶基因序列 ,设计并合成一对引物 ,从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出端粒酶基因 ,进行测序及利用生物信息学技术对端粒酶基因进行了分析。结果 得到了 2 3kp的恶性疟原虫海南株端粒酶基因。结论 恶性疟原虫端粒酶基因的克隆 。
- 陈守义徐劲李军涛武忠銮胡旭初余新炳
- 关键词：恶性疟原虫端粒酶亚基基因基因序列
- 弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体的构建及筛选被引量：6
- 2004年
- 目的 构建弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体 ,建立基因敲除突变株 ,为进一步探讨SAG3功能和弓形虫侵入宿主细胞机制提供可行的研究方法。方法 用基因克隆方法将SAG31.5 3kb和 2 .81kb两个同源序列分别插入TUB5 /CAT质粒中 ,构建置换型打靶载体 ,氯霉素乙酰转移酶 (CAT)抗性基因作为筛选标记 ,采用电转移转染细胞方法进行基因打靶 ,建立突变型的弓形虫株 ,采用PCR、酶切分析和SouthernBlot杂交方法筛选鉴定。结果 构建了弓形虫RH株 5’SAG3 TUB5 /CAT 3’SAG3置换型载体 ,获得了敲除SAG3基因的弓形虫突变株 ,建立基因敲除突变株 ,获得了阳性的筛选克隆 ,经鉴定证明基因打靶结果准确。结论 通过构建基因打靶载体 ,可有目的地敲除弓形虫膜抗原基因 ,为进一步研究弓形虫侵入机制 ,探讨弓形虫病防治提供可行的方法。
- 韦相才钟兴明郑焕钦陈观今王景圆
- 关键词：弓形虫膜抗原基因打靶
- 华支睾吸虫溶血磷脂酶基因的识别、克隆和序列分析被引量：1
- 2004年
- 目的 筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因 ,并将所发现的华支睾吸虫溶血磷脂酶 (csLysoPLAH)基因编码区克隆到原核表达质粒PGEX 4T 1和真核表达质粒pcDNA3上 ,为进一步研究其功能奠定基础。 方法 对华支睾吸虫cDNA文库进行随机筛选并测序 ,在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析 ,识别华支睾吸虫新基因 ,并应用Motifsan、NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行结构域分析。根据PGEX 4T 1和 pcDNA3上的克隆位点及所发现的csLysoPLAHcDNA编码序列设计引物 ,进行PCR扩增 ,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体PGEX 4T 1和真核表达载体 pcDNA3上。构建的PGEX 4T 1 csLysoPLAH、pcDNA3 csLysoPLAH重组表达质粒经PCR、双酶切及测序证实。 结果 发现csLysoPLAH基因 ,完整阅读框含 70 8个碱基 ,编码 2 3 5个氨基酸 ,理论分子质量为 2 5 .2 62 8ku ,理论pI为6.0 3。序列分析表明 ,csLysoPLAH编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性 ,csLysoPLAH具有磷脂酶 /羧酸酯酶保守功能域和完整的脂酶保守功能域 ,并含有丝氨酸酯酶特征性的标签肽 (即GXSXG)。所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。 结论 发现华支睾吸虫溶血磷脂酶基因 ,并成功构建原核和真核重组表达质粒。
- 何东苟余新炳吴忠道徐劲吴德胡旭初陈守义
- 关键词：华支睾吸虫溶血磷脂酶克隆
