天津医科大学基础医学院细胞生物学系
- 作品数：35 被引量：46H指数：4
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- 利用CRISPR/Cas9技术构建Aff4基因敲除B16-F10细胞系及AFF4的多克隆抗体制备
- 2023年
- 目的:利用CRISPR/Cas9技术构建ALF转录伸长因子4(AFF4)基因敲除的小鼠黑色素瘤细胞(B16-F10),自主制备特异的AFF4多克隆抗体。方法:设计一对分别靶向小鼠Aff4基因第3个外显子和第4个内含子的向导RNA(sgRNA)。将构建成功的重组质粒转染至B16-F10细胞中,并利用抗性筛选出单克隆细胞,进行基因型鉴定和AFF4表达水平检测。验证自主制备的AFF4多克隆抗体的特异性。结果:通过基因组DNA鉴定获得两株正确的单克隆细胞系,其Aff4基因mRNA水平(t=53.08,P<0.001)和AFF4蛋白表达水平(t=15.17,P<0.001)显著降低。免疫共沉淀实验和蛋白免疫印迹实验证明自主制备的抗人/鼠AFF4多克隆抗体特异性良好(t=264.7,P<0.0001)。结论:成功构建了Aff4基因敲除的B16-F10稳定细胞系,并且成功制备抗AFF4蛋白的多克隆抗体。
- 张佳慧阎晗胡德庆
- 关键词：表观遗传原核表达多克隆抗体
- 负载酪氨酸酶抑制肽的牛奶外泌体抑制酪氨酸酶活性及黑色素生成研究被引量：1
- 2022年
- 目的:探讨酪氨酸酶抑制肽(YRS)功能化的牛奶外泌体(mEXOYRS),对酪氨酸酶活性及黑色素生成的抑制作用。方法:通过超速离心法获取牛奶外泌体(mEXO);利用外泌体特异锚定肽CP05将YRS修饰在mEXO表面,获得mEXOYRS,随后通过流式细胞仪分析YRS的负载效率;在黑色素瘤细胞B16-F10中,检测细胞对mEXOYRS的摄取效率以及YRS与酪氨酸酶的共定位效率,评估mEXOYRS对B16-F10黑色素瘤细胞酪氨酸酶活性的抑制效果及对黑色素合成的抑制作用;进一步将mEXOYRS均匀涂抹于Nude BALB/c小鼠黑色素瘤细胞B16-F10所成皮下瘤模型上,评估其在体内对黑色素合成的抑制作用;通过对C57BL/6小鼠表面皮肤涂抹mEXOYRS,评估其对小鼠毛囊的着色程度及小鼠皮肤的美白效果。结果:YRS通过外泌体特异锚定肽CP05高效负载至mEXO,并且不影响mEXO的形态结构及标志性蛋白的表达;在B16-F10黑色素瘤细胞摄取实验中,mEXO能够增强YRS与细胞内酪氨酸酶共定位的效率,在1周、2周及6周时均显著抑制细胞产生黑色素(F=56.117、48.954、560.006,均P<0.05);在Nude BALB/c小鼠黑色素皮下瘤模型中,与YRS组相比,mEXOYRS更好的抑制了黑色素的产生;在C57BL/6小鼠模型中,mEXOYRS降低了黑色素的产生,并显著降低了黑色素含量(F=173.083,P<0.05)及酪氨酸酶活性指标(F=34.156,P<0.05),取得了美白效果。结论:YRS修饰的mEXO可通过内体转运途径,靶向运输到酪氨酸酶处,降低酪氨酸酶活性,并有效抑制黑色素生成,提高YRS的美白效果。
- 栗瑞斌王倩张雷杰荆韧威尹海芳
- 关键词：黑色素瘤靶向治疗
- 电离辐射对破骨细胞分化过程中RANK表达的影响及其致骨损伤的分子机制被引量：1
- 2013年
- 目的:研究电离辐射对破骨细胞分化过程中核因子κB受体活化因子(RANK)mRNA和蛋白表达的影响,探讨辐射导致骨损伤的分子机制。方法:采用50μg·L-1核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞。RQW264.7细胞分为对照组(未处理)、RANKL处理组(50μg·L-1RANKL处理)、照射处理组(2Gyγ射线照射)、照射联合RANKL处理组(50μg·L-1 RANK处理+2Gyγ射线照射)。采用抗酒石酸磷酸酶(TRAP)染色法检测各组破骨细胞的分化状态;采用PCR法检测各组细胞中RANK mRNA的表达水平;采用Western blotting法检测各组细胞中RANK蛋白的表达水平。结果:RAW264.7细胞经过RANKL诱导7d后,TRAP染色呈现阳性,表明已经成功分化成为破骨细胞。与对照组比较,RANKL处理组和照射处理组破骨细胞前体细胞中RANK mRNA和蛋白的表达水平上调(P<0.05);与RANKL处理组比较,照射联合RANKL组破骨细胞前体细胞中RANK mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:电离辐射可以促进破骨细胞前体细胞的增殖和成熟,增加其活性,但是对破骨细胞的增殖、成熟与活性却有一定的抑制作用。
- 周慧杨冰唐泉孙元明韩英樊飞跃刘晓冬贾立立
- 关键词：电离辐射破骨细胞RANK
- 己糖对杜兴肌肉萎缩症核酸药物Pip5e-PMO跳读活性研究被引量：1
- 2019年
- 目的:在杜兴肌肉萎缩症模型上探究己糖混合物对核酸药物Pip5e-PMO介导的外显子跳读活性的促进作用。方法:选择成年mdx小鼠为测试动物模型,通过局部肌肉和系统尾静脉注射,比较Pip5e-PMO与己糖和生理盐水联用的作用效果,利用免疫荧光(IHC)和蛋白印迹法(Western blot)检测dystrophin阳性肌纤维的数量和分布及dystrophin蛋白的表达水平;利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测外显子跳读。结果:在局部肌肉给药试验中,己糖能够促进Pip5e-PMO诱导dystrophin蛋白表达水平(P<0.05)。在系统试验中,对己糖和生理盐水组比较发现:按15 mg/kg的剂量单次系统尾静脉注射Pip5e-PMO,骨骼肌中dystrophin蛋白表达恢复至正常水平的50%;在心脏中,也检测到明显的dystrophin恢复表达和外显子跳读。但两组无显著性差别(P>0.05)。结论: Pip5e-PMO可诱导有效的外显子跳读和dystrophin蛋白表达,但己糖对其促进效果有限。
- 宁含含顾犇韩刚林曹瑞尹海芳
- 关键词：己糖抗肌萎缩蛋白
- “十四五”胶质瘤基础与转化研究目标与共识
- 2021年
- 国家“十四五”发展规划和2035年远景目标纲要提出,把保障人民健康放在优先发展的战略位置,全面推进健康中国建设。目前,我国神经系统肿瘤的发病人数和死亡人数均居世界首位,严重威胁我国人民身体健康。在此大背景下,中国医师协会脑胶质瘤专业委员会基础研究与转化学组整理总结目前胶质瘤研究进展,着眼于全新诊断治疗的策略突破、发病和耐药机制的深层次研究、全新胶质瘤动物模型的开发探索以及我国胶质瘤标准化资源共享平台的建立,旨在阐明中国胶质瘤研究方向,加速推动胶质瘤基础研究到临床应用的转化突破,实现科研成果从专利到临床转化的整体管线布局。
- 崔晓腾方川刘博杨叶敏华曾亮万锋谢琦汪强虎汪秀星檀艳丽周秀萍吴旭东李学军郭洪波尤永平康春生
- 关键词：胶质瘤
- 利用CRISPR/Cas9n系统构建Asxl2基因敲除的NIH3T3稳定细胞系被引量：3
- 2015年
- 目的利用CRISPR/Cas9n系统在NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞系中敲除Asxl2基因。方法设计一对靶向小鼠Asxl2基因第5个外显子的小向导RNA(sg RNA),分别克隆进p X462载体。将测序鉴定正确的重组质粒转染至NIH3T3细胞中,利用有限稀释法得到单细胞,通过培养获得单克隆细胞系。提取单克隆细胞系基因组DNA,ge-notyping PCR扩增出靶位点附近的DNA片段并测序。利用Western blot方法检测细胞株中Asxl2的敲除效果。结果成功构建靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重组质粒。将2个重组质粒共转染NIH3T3细胞,嘌呤霉素筛选后得到亚克隆细胞系,并且经genotyping PCR测序验证得到一株正确的单克隆细胞系。Western blot证实敲除Asxl2后,该NIH3T3细胞系中Asxl2蛋白表达缺失。结论通过这个系统得到了靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重组质粒及稳定敲除Asxl2的NIH3T3细胞系。
- 方佳萍赵秀娟齐艳王玺吴旭东娄建石
- 关键词：表观遗传
- NICD表达下调对辐射损伤小鼠成骨细胞系MC3T3-E1增殖和功能基因表达的影响
- 2018年
- 目的 利用RNA干扰抑制小鼠成骨细胞系MC3T3-E1表达Notch信号通路胞内结构域（NICD），探讨靶向抑制NICD表达对辐射损伤MC3T3-E1细胞的增殖和相关功能基因表达的影响。方法 建立抑制NICD表达的MC3T3-E1细胞株，利用实时定量PCR （qRT-PCR）和Western blot法检测其NICD基因的表达。MC3T3-E1细胞和NICD RNA干扰MC3T3-E1细胞经2 Gy γ射线照射后，用BrdU掺入法和qRT-PCR法检测上述细胞的增殖及相关功能基因的表达水平。使用Student-Newman-Keuls进行组间差异分析，两组间比较采用t检验。结果 用RNA干扰技术可靶向抑制MC3T3-E1细胞表达NICD。抑制NICD表达可干扰前体成骨细胞和成骨细胞的增殖。2 Gy照射后，前体成骨细胞和成骨细胞以及NICD RNA干扰的成骨细胞的增殖明显下降，各靶细胞的相关功能基因与照射前相比的变化如下：①2 Gy照射后的前体成骨细胞成骨特导性转录因子（Runx2）表达上调，差异有统计学意义（t=2.353，P〈0.05），NICD RNA干扰的前体成骨细胞Runx2表达下调，差异有统计学意义（t=2.353，P〈0.05）；②2 Gy照射后的前体成骨细胞和成骨细胞以及NICD RNA干扰的前体成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）表达上调，差异有统计学意义（t=3.182、3.345、3.555，均P〈0.05），NICD RNA干扰的成骨细胞ALP表达下调，差异有统计学意义（t=5.045，P〈0.01）；③2 Gy照射后前体成骨细胞核因子κB受体活化因子配体（RANKL）表达下调，差异有统计学意义（t=2.541，P〈0.05），成骨细胞和NICD干扰的前体成骨细胞RANKL表达上调，差异有统计学意义（t=3.299，P〈0.05；t=10.212，P〈0.01），而抑制NICD表达则发生相反变化，差异无统计学意义（t=0.765，P〉0.05）；④2 Gy照射后的前体成骨细胞和成骨细胞骨保护素（OPG）表达下调，差异有统计学意义（t=2.994、2.782，均P〈0.05），抑制NICD表达使前体成骨细胞OPG表达上调，�
- 边佩鲜杨冰王靖雅孙元明龙伟
- 关键词：MC3T3-E1细胞
- 双特异性磷酸酶2对胃癌细胞增殖凋亡的影响及机制研究
- 2018年
- 目的探讨双特异性磷酸酶2(DUSP2)基因对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其可能的机制。方法首先利用在线分析工具KM plotter分析876例胃癌患者DUSP2表达高低对其总体生存率的影响,并在多种胃癌细胞株(MKN-45、SGC-7901、HGC-27、N-87)中检测DUSP2的表达。进一步构建DUSP2过表达慢病毒载体,包装病毒感染MKN-45细胞,筛选出DUSP2稳定过表达的胃癌细胞株,以空载慢病毒转染并筛选后的胃癌细胞为对照。采用MTS细胞增殖实验检测DUSP2上调表达对胃癌细胞增殖能力的影响;Annexin V-FITC/PI双染流式检测细胞凋亡变化;蛋白质印迹法(Western blot)检测DUSP2、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p-ERK(Thr202/Tyr204)、P38、p-P38等蛋白表达水平。结果高表达DUSP2的胃癌患者较低表达者有明显的生存优势,并且DUSP2在多株胃癌细胞中呈低表达。Western blot结果显示DUSP2稳定过表达的胃癌细胞(实验组)中DUSP2表达较对照组明显上调,DUSP2稳定过表达的胃癌细胞株构建成功。MTS实验结果表明,实验组细胞活力较对照组明显下降。实验组细胞凋亡率明显高于对照组。Western blot结果表明,实验组细胞中p-ERK(Thr202/Tyr204)及p-P38表达较对照组显著下调。结论上调DUSP2的表达可显著抑制胃癌细胞的增殖,并促进其凋亡,其机制与DUSP2抑制了ERK、P38的磷酸化水平有关。
- 刘师伟李辉张奇雪蒋昭赵秀娟吴云丹
- 关键词：胃肿瘤细胞外信号调节MAP激酶类P38丝裂原活化蛋白激酶类
- 肿瘤发生的表观遗传学:进展与临床意义被引量：13
- 2012年
- 表观遗传（epigenetics）指所有不通过DNA序列改变就能影响基因表达（从而决定细胞乃至个体表型）的、可遗传的（即可伴随细胞分裂传递下去）调控方式,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、miRNA、朊病毒等。表观遗传调控在干细胞自我更新、定向分化、器官发育等生命过程中起着至关重要的作用：
- 王先火赵秀娟邱立华王华庆王玺
- 关键词：表观遗传肿瘤DNA甲基化组蛋白修饰
- 应用CRISPR/Cas9系统在G401细胞株中敲除p21基因被引量：1
- 2016年
- 目的运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在人恶性横纹肌样瘤细胞株G401中敲除p21基因。方法通过反转录定量PCR(RT-q PCR)及Western blot检测各瘤细胞株中p21的表达,针对p21基因作用的功能域,设计了靶向人p21基因第3个外显子的向导RNA(sg RNA),克隆入lenti CRISPR v2载体。将测序及酶切鉴定正确的重组质粒在293T工具细胞中制备慢病毒颗粒并感染G401细胞,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,显微镜下挑取单克隆细胞团并继续培养获得G401单克隆细胞株。提取单克隆细胞株RNA及蛋白,利用RT-q PCR及Western blot方法检测细胞株中p21的敲除效果。结果 p21在人横纹肌样瘤细胞中高表达。成功构建靶向p21基因的lenti CRISPRv2-sg RNA重组慢病毒质粒。与对照组相比,筛选得到的G401亚克隆细胞系中p21蛋白表达缺失。结论针对难转染的G401细胞,应用CRISPR/Cas9系统成功构建了p21基因敲除的稳定株,为后续深入研究p21在人恶性横纹肌样瘤中的作用机制奠定了基础。
- 赵秀娟陈万标张沛涛张娜楚晓文白向阳杨冰吴旭东王玺
- 关键词：横纹肌瘤P21基因敲除慢病毒
