广东省生物工程药物重点实验室
- 作品数：31 被引量：60H指数：5
- 相关作者：张赛何艳喜温思霞罗勇更多>>
- 相关机构：暨南大学国家工程研究中心上海市第十人民医院更多>>
- 发文基金：广东省科技攻关计划广东省科技计划工业攻关项目国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学理学更多>>
- miR-122过表达转基因小鼠质粒构建及其功能验证被引量：1
- 2011年
- 目的:比较两种miR-122转基因小鼠过表达载体构建方法,为建立miR-122过表达转基因小鼠奠定基础。方法:PCR扩增长约291bp的pre-miR-122的序列,分别定向克隆到pBROAD3-GFP载体GFP基因上游内含子或下游3′UTR区域,两种质粒分别转染293T细胞,Q-PCR检测miR-122和GFP的表达水平,并观察GFP绿色荧光。miR-122 sensor reporter是将3个miR-122成熟序列的反义序列串联克隆至psiCHECK2载体luciferase 3′UTR中,然后分别与2种miR-122过表达质粒载体共转染293T细胞,最后检测荧光素酶活性来鉴定miR-122调控功能。结果:2种构建方法的miR-122表达水平都明显增高,而只有插入到GFP基因3′UTR的质粒表达GFP功能正常。结论:构建microRNA过表达载体时,microRNA位于报告基因3′UTR区域不会影响microRNA和报告基因的功能;构建的两种miR-122过表达质粒载体都可应用到转基因小鼠研究中,而将miR-122插入到GFP下游的方法则更利于miR-122的表达。
- 马纪孙奋勇张越洪岸
- 关键词：MIR-122过表达SENSORREPORTER转基因小鼠
- 基于易错PCR的黄曲霉毒素解毒酶体外分子定向进化被引量：11
- 2011年
- 运用定向进化-易错PCR方法,提高黄曲霉毒素解毒酶的活力及稳定性,并结合辣根过氧化物酶(HRP)-隐性亮绿(RBG)快速高通量筛选系统,构建了库容约为104的突变体库。经过两轮易错PCR,最终分别获得了耐高温70℃突变酶A1773、pH 4.0稳定性的突变酶A1476,pH 4.0和pH 7.5均表现稳定性的突变酶A2863,其酶活力比野生酶分别提高了6.5倍、21倍和12.6倍。经序列分析表明,发现突变酶A1773发生了Glu127Lys和Gln613Arg突变;突变酶A2863发生了Gly73Ser、Ile307Leu、Val596Ala、Gln613Arg突变;突变酶A1476发生了Ser46Pro、Lys221Gln、Ile307Leu和Asn471Ile突变。结果为进一步了解黄曲霉毒素解毒酶的结构与功能之间的关系提供了参考。
- 张赛邢克克胡亚冬谢春芳刘大岭姚冬生
- 关键词：黄曲霉毒素解毒酶稳定性定向进化易错PCR
- 假蜜环菌黄曲霉毒素氧化酶的基因克隆、表达、纯化及酶学性质分析(英文)被引量：9
- 2011年
- 【目的】黄曲霉毒素氧化酶(aflatoxin-oxidase,AFO)来源于假蜜环菌(Armillariella tabescens)的细胞内提取物,具有转化黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)的特性。为更进一步了解该酶的性质,我们克隆了AFO的基因,并进行了重组AFO蛋白的表达、纯化和酶学性质分析。【方法】本研究利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得的AFO短肽序列设计简并引物进行逆转录,再通过cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术获得了AFO基因的全长cDNA序列。构建重组表达载体pPIC9-afo,在毕赤酵母中进行重组AFO(rAFO)的融合分泌表达,用Ni离子螯合层析进行rAFO的纯化,获得有活性的rAFO后,对其进行肽质量指纹(peptide mass fingerprinting,PMF)鉴定和酶学性质分析。【结果】黄曲霉毒素氧化酶(AFO)基因的开放阅读框为2088 bp,编码695个氨基酸;肽质量指纹鉴定结果显示重组AFO的肽片段序列覆盖率为63.2%。活性测定表明纯化后的重组AFO(rAFO)比活力为234 U/mg;对rAFO进行酶学性质分析表明,对于底物黄曲霉毒素B1,rAFO的Km值为3.93±0.20×10-6 mol/L;反应最适温度为30℃,最适pH为6.0;30℃放置90 min后酶活力下降50%;rAFO在pH5.5-7.0之间酶活力较稳定,相对活力维持在51%-65%之间。【结论】本文第一次成功克隆并重组表达了一种具有黄曲霉毒素B1转化功能的酶——黄曲霉毒素氧化酶(aflatoxin-oxidase,AFO),纯化后的重组AFO(rAFO)具有较好的黄曲霉毒素B1转化活性,为进一步研究和应用奠定了基础。
- 温思霞管敏周涛曹红谢春芳刘大玲姚冬生
- 关键词：CDNA末端快速扩增毕赤酵母
- 重组鲨鱼血管生成抑制因子功能活性区蛋白纯化工艺的优化
- 2012年
- 目的优化重组鲨鱼血管生成抑制因子(Shark angiogenesis inhibition factor,SAIF)功能活性区(aSAIF)蛋白的纯化工艺。方法利用离子交换层析和镍柱亲和层析对带有组氨酸标签的融合蛋白His6-SUMO-aSAIF进行纯化。纯化后的融合蛋白经SUMO蛋白酶切除小分子泛素样修饰蛋白(Small ubiquitin-related modifier,SUMO)标鉴,再经镍柱二次亲和层析获得非融合aSAIF蛋白,采用WST-8法对其进行血管生成抑制活性检测。结果优化的纯化工艺参数为:离子交换层析采用0.2 mol/L的NaCl进行洗脱;亲和层析的洗脱液为20 mmol/L磷酸盐,500 mmol/L NaCl,250 mmol/L咪唑,pH 7.4;SUMO蛋白酶与融合蛋白的最佳酶切比例为1∶480,酶切时间为1 h。最终获得的aSAIF蛋白纯度可达95%,具有较好的抑制血管内皮细胞增殖的活性,且呈剂量依赖性。结论已成功建立了aSAIF的纯化工艺,为后续大规模生产及抑制血管生成机制的研究奠定了基础。
- 彭雯丹罗勇陈钧王亚玉黎美香谢秋玲
- 关键词：纯化工艺
- 重组人可溶性PDGFRβ/Fc在昆虫细胞Sf9中的表达被引量：1
- 2009年
- 【目的】利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达血小板源性生长因子受体β(PDGFRβ)链膜外区与人IgGFc片段的可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc,并检测重组蛋白的特异性和生物活性。【方法】采用Bac-to-Bac系统,构建重组转移质粒pFastbac-sPDGFRβ/Fc,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,使目的基因与杆状病毒基因组DNA发生位点特异性重组,获得重组病毒DNA,将其通过脂质体转染昆虫细胞Sf9获得重组病毒。将该重组病毒感染Sf9无血清细胞系,在Sf9细胞中表达sPDGFRβ/Fc,对表达产物进行Western blotting检测和Protein A亲合层析纯化,并进一步通过MTT法检测获得的重组蛋白生物学活性。【结果】重组病毒感染Sf9细胞后,经Western blotting分析,能检测到一条分子量约为97kDa的特异性条带,与目的蛋白大小相符。通过ProteinA亲和层析,获得了纯度达75%以上,表达量为1μg/mL细胞培养上清的重组融合蛋白,MTT结果显示该重组融合蛋白sPDGFRβ/Fc具有抑制PDGF刺激的Balb/c3T3细胞增殖的能力。【结论】具有生物活性的重组可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc可在昆虫细胞中成功地得到表达。
- 谢秋玲刘兰刘秀贵张玲徐丽慧洪岸
- 关键词：血小板源性生长因子受体昆虫细胞重组蛋白MTT法
- 葡萄糖氧化酶的有机相共价固定化
- 葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)属于氧化还原酶类(ECl.1.3.4),能专一行地将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢,广泛存在于动植物和微生物体内。该酶主要应用于食品卫生、饲料工业和生物医药等...
- 周涛朱雄军苏建华谢春芳刘大岭姚冬生
- 关键词：葡萄糖氧化酶有机相酶活力
- 文献传递
- 人血小板源性生长因子受体β启动子的结构与功能分析被引量：2
- 2010年
- 通过PCR扩增人血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)基因启动子片段,经双酶切后克隆到pGL3-basic载体构建了5个PDGFR-β基因启动子5′系列缺失重组载体,与作为内参的pRL-TK共转染人脐静脉内皮细胞(ECV304,HUVEC)后,通过荧光素酶活性检测鉴定出人PDGFR-β启动子中具有转录调控作用的2个活性区(-983～+53)和(+540～+1457),前者执行正调控,后者则起负调控作用.这2个转录活性区分别含有在人、大鼠、小鼠PDGFR-β基因启动子区都高度保守的区域A-box、B-box和C-box,凝胶迁移或电泳迁移率检测(EMSA)证实,核因子能与B-box*、C-box*特异结合.
- 张传宇孙奋勇时宿妹马纪谢秋玲
- 关键词：人脐静脉内皮细胞启动子血管生成
- 黄曲霉毒素氧化酶的酶动力学研究被引量：4
- 2012年
- 黄曲霉毒素氧化酶(AFO)是来自Armillariella tabescens的具有降解黄曲霉毒素作用的蛋白质酶.本实验室成功克隆和以原核系统表达了黄曲霉毒素氧化酶,前期的工作中用传统测量表观酶促反应速度的方法对AFO进行了酶动力学的研究,采用了在酶反应的结束点进行分析,因此不能够连续监测酶的反应过程,且实验过程较为繁琐,影响因素较多,对动力学常数的测量存在不够准确的可能.本实验使用等温滴定微量热技术对该酶的酶促动力学进行研究,该方法通过酶与底物的滴定实验直接监测酶反应过程中的热量变化而对酶动力学进行分析,滴定产生一个完整的Michaelis-Menten曲线,通过拟合分析测得黄曲霉毒素氧化酶对AFB1催化的米氏常数KmAFB1=3.34×10-7mol/L;酶催化ST反应的米氏常数KmST=1.06×10-7mol/L.对AFB1和ST酶转换系数别为KcatAFB1=2.7 min-1和KcatST=1.7 min-1.结合函分别为ΔHAFB1=-1.686×107 J/mol,ΔHST=-9.092×106 J/mol.与传统方法相比,ITC方法在酶动力学研究上具有简便、快速和准确的优点并具有普适性.
- 胡丽莎谢春芳刘大岭
- 关键词：酶动力学
- 人金属硫蛋白在乳酸菌中的融合表达及其预防食源性镉污染的应用被引量：1
- 2018年
- 目的：镉（Cd）是一种重要的环境污染物,其具有半衰期长、不能生物降解等特性使之易于在人体重要脏器中蓄积并对人身体健康造成不可逆的损伤。为此,减少镉的摄入,尤其是经胃肠道,是预防人体慢性镉中毒的有效方法。方法：构建以α-半乳糖苷酶作为筛选标记、表达金属硫蛋白融合蛋白（GST-SUMO-MT）的重组乳酸乳球菌MG1363/p M-GSMT。原子吸收光谱法分析重组乳酸菌对Cd^（2＋）和Zn~＋的结合能力。以灌胃方式,对雄性Sprague-Dawley大鼠每天口服不同剂量的重组乳酸菌（2×10~9~2×10^（11）CFU/d）及CdCl_2溶液[5mg/（kg·d）],连续处理56天。收集实验动物肝、肾、脑及睾丸,利用原子吸收光谱法检测这些脏器中镉离子的含量。生化分析检测血清中尿素及丙氨酸转氨酶的含量。石蜡切片及苏木精-伊红染色分析各组织的病理变化。结果：获得不含抗生素抗性的重组乳酸菌MG1363/p M-GSMT,其吸附Cd^（2＋）、Zn^（2＋）能力比对照组分别提高3.52倍和1.60倍。动物实验结果显示,镉能在肝、肾、脑及睾丸中蓄积,并对这些器官造成明显的病理损伤。原子吸收光谱分析、血清生化指标及病理切片结果都显示,重组乳酸菌能有效降低胃肠道中镉的摄入,进而减少Cd^（2＋）在各脏器中的蓄积及对器官功能的损伤。结论：为预防人体食源性慢性镉中毒提供了一种有效的生物材料和使用方法。
- 彭德莲刘霞黄亚东黄亚东苏志坚
- 关键词：金属硫蛋白镉污染
- 利用N-糖基化修饰对β-甘露聚糖酶Man47的稳定性改造被引量：3
- 2013年
- N-糖基化是真核生物蛋白质最重要的翻译后修饰之一。以Armillariella tabescensβ-甘露聚糖酶Man47为研究对象,利用计算化学对A.tabescensβ-甘露聚糖酶Man47进行理性设计,经过分子对接、二级结构分析和糖基化的可行性分析后,构建具有EAS(enhanced aromatic sequence)序列的突变体g-123作为N-糖基化的突变位点。将其整合到毕赤酵母表达载体SMD1168上,通过电转化得到重组转化子。最后对突变体g-123的温度稳定性、酸碱稳定性、胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性进行分析。结果表明:糖基化A.tabescensβ-甘露聚糖酶Man47突变体g-123与野生型相比,其热稳定性、酸碱稳定性、蛋白酶抗性均得到不同程度的改善。
- 谢春芳黎玉凤刘大岭姚冬生
- 关键词：N-糖基化翻译后修饰蛋白质设计生物信息学
