刘建刚
- 作品数：8 被引量：14H指数：2
- 供职机构：中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家科技基础条件平台建设计划甘肃省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 驽巴贝虫病间接ELISA检测方法的建立被引量：9
- 2010年
- 目的克隆表达驽巴贝虫诊断抗原基因BC48,建立间接ELISA诊断方法。方法从感染驽巴贝虫的毛驴血液中提取虫体基因组DNA,利用PCR技术扩增BC48基因,将其克隆入表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌感受态细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用镍柱亲和层析法纯化蛋白。以该蛋白作为诊断抗原建立间接ELISA诊断方法 ,对反应条件进行优化,并对该方法的特异性和敏感性进行评价。结果扩增获得1272bp的BC48基因片段。重组表达质粒pET-28a-BC48诱导后获得大小约为Mr46000的可溶性融合蛋白,纯化后蛋白浓度为12.98mg/ml。间接ELISA方法条件优化的结果显示,最佳抗原包被浓度为65μg/ml,最适血清稀释度为1∶80,该融合蛋白可特异性地与驽巴贝虫感染血清结合,而不与马泰勒虫感染血清及阴性血清反应。使用该方法与镜检法检测17份散养毛驴血清样品,阳性检出率分别为3/17和2/17。结论以BC48重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于马属动物驽巴贝虫病的检测。
- 龚真莉刘光远谢俊仁柴慧萍张丽艳李知新田占成王路刘建刚
- 关键词：纯化ELISA
- 长角血蜱半饱血雄蜱抑制性消减cDNA文库的构建及MIF基因的原核表达
- 长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是我国流行最广泛和最重要的蜱种之一,主要叮咬牛、羊及多种脊椎动物,是病毒、立克次氏体、螺旋体、细菌、原虫、支原体和衣原体等多种病原重要的传播媒介。长角血蜱及其...
- 刘建刚
- 关键词：巨噬细胞游走抑制因子原核表达
- 文献传递
- 马属动物梨形虫病的PCR鉴别诊断技术研究
- 马属动物是国内仅次于牛和羊的主要家畜种群,在我国现有的农业生产条件下,马属动物依然是大部分农村(特别是山区和广大西部地区)的主要使役动物。目前,该动物的梨形虫病流行非常广泛,危害非常严重,给国民经济和人民生活造成极大的威...
- 龚真莉刘光远谢俊仁张丽艳柴慧萍李知新田占成王路刘建刚张林
- 关键词：马属动物梨形虫病PCR
- 文献传递
- 长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库的免疫筛选与初步分析
- 蜱的免疫预防是目前国内外研究的热点,以抗血清为探针筛选cDNA表达文库是获取功能性抗原基因的有效方法之一。为了获得抗长角血蜱免疫原基因,用兔抗长角血蜱饥饿雌蜱全蜱蛋白阳性血清对长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库进行免疫学筛...
- 张丽艳刘光远田战成谢俊仁刘建刚
- 文献传递
- 长角血蜱成蜱免疫家兔模型的建立及对生长发育的影响
- 每隔2周用长角血蜱成蜱定量感染家兔,成功构建了具有不同抵抗力的家兔免疫模型。ELISA检测结果表明,家兔血清中的抗体效价从初次叮咬后第3周开始呈阳性,随着叮咬次数的增加抗体水平逐渐地上升,第11周时达到高峰。具有一定抵抗...
- 谢俊仁刘光远田占成龚真莉刘建刚张丽艳
- 关键词：长角血蜱免疫模型生长发育
- 文献传递
- 长角血蜱隐性抗原基因HI05的克隆和原核表达
- 目的对长角血蜱饥饿雌性成蜱cDNA表达文库进行免疫学筛选得到H105基因,同源性比对发现该基因与青海血蜱Hq05基因同源性为84%,文献表明Hq05表达蛋白对蜱的产卵率及孵化率均有影响。因此本实验以H105为研究对象,确...
- 张丽艳刘光远田占成谢俊仁龚真莉刘建刚
- 关键词：长角血蜱克隆原核表达
- 文献传递
- 长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库的构建与分析被引量：3
- 2009年
- 为构建长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库,获得长角血蜱雄性成蜱在半饱血状态下的特异表达基因,用抑制消减杂交方法构建以pGEM-T Easy为载体的长角血蜱半饱血雄蜱全蜱cDNA文库,测序并进行生物信息学分析。以新合成的长角血蜱饥饿和半饱血雄蜱cDNA第一链为模板,用RT-PCR方法对从文库中挑选的5个表达序列标签(EST)进行鉴定。初步获得18个EST,BlastX分析显示,所得cDNA编码的功能性蛋白主要包括信号传导、组织形态形成、转录调节和糖类代谢等相关蛋白。RT-PCR鉴定结果显示,随机挑选的5个新EST中有3个在半饱血状态下差异表达。结果表明,成功地构建了长角血蜱雄性全蜱抑制消减杂交文库,获得了有潜在生物学功能的EST。
- 刘建刚刘光远田占成谢俊仁龚真莉张丽艳
- 关键词：长角血蜱CDNA文库
- 长角血蜱新基因HL05全长序列的克隆与原核表达
- 2011年
- 以兔抗长角血蜱饥饿雌蜱全蜱蛋白阳性血清为探针,对长角血蜱饥饿雌蜱cDNA表达文库进行免疫学筛选,获得一个阳性克隆HL05。经5′-RACE技术得到HL05基因的全长序列。HL05基因全长1 053bp,开放阅读框长540bp,编码179个氨基酸,预计蛋白分子质量为20.01ku。序列同源性分析表明,该基因为长角血蜱新基因。对推导的氨基酸序列进行生物信息学分析,表明HL05蛋白为分泌型蛋白,无跨膜区,具有较高的抗原指数。将该基因亚克隆后连接到原核表达载体pGEX-4T-1上,转入BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导后得到大小为46ku左右的重组蛋白,与预期大小一致。Western-blot结果显示兔抗长角血蜱成蜱全虫抗体能够识别该重组蛋白。
- 张丽艳刘光远田占成谢俊仁龚真莉刘建刚
- 关键词：长角血蜱全长原核表达
