刘济铭
- 作品数：4 被引量：10H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市渝中区科技计划项目重庆市科委基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 应用人工转录因子技术抑制乙型肝炎病毒复制
- 2015年
- 目的设计与构建特异性结合乙型肝炎病毒增强子1(HBV Enh1)的锌指蛋白人工转录因子(ZFP-ATF),检测在Hep G2.2.15细胞内的表达、对细胞生长影响及观察其抑制HBV DNA复制与表达的作用。方法构建含结合结构域ZFP与抑制性效应结构域Krüppel相关盒(KRAB)的人工转录因子(ATF),进行相关修饰、优化后,将人工合成ATF核酸序列插入真核表达质粒载体pc DNA3.1(^+),测序鉴定其正确性,X-treme GENE HP转染Hep G2.2.15细胞,共聚焦显微镜下观察ATF蛋白表达情况,CCK-8法检测ATF对细胞生长的影响,ATF转染24、48、72 h后,采用实时定量PCR、ELISA、Western blot法检测对HBV DNA复制与表达的抑制作用。结果成功构建pc DNA3.1-ATF(nls-ZFP-KRAB-FLAG)真核表达载体,ATF在Hep G2.2.15细胞中能正常表达,且对细胞生长无明显的影响,ATF具有抑制HBV DNA复制与表达的作用,在转染72 h后抑制作用达最高,抑制率达68.0%。结论构建的ATF在Hep G2.2.15细胞中能够正常表达且无毒性作用,可特异性结合HBV Enh1靶序列并具有抑制HBV DNA复制与表达的作用。
- 李中堂罗伟付愚蒋清虎刘济铭吴忠均
- 关键词：锌指蛋白人工转录因子乙型肝炎病毒增强子
- USP9X低表达通过下调Mcl-1促进肝癌细胞凋亡被引量：6
- 2014年
- 研究抑制泛素特异性蛋白酶9X(ubiquitin-specific protease 9X,USP9X)对人肝癌(primary hepatocellular carcinoma,HCC)细胞SMMC7721和HepG2中髓细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)蛋白的表达调控及对细胞凋亡和生长活力的影响。实验分为USP9X-siRNA组和阴性对照NC组两组进行分析。通过Western blot技术分别检测USP9X在肝癌细胞SMMC7721、HepG2和正常人肝细胞株L02中的蛋白表达情况;应用化学合成USP9X-siRNA转染肝癌细胞SMMC7721和HepG2,通过Western blot、流式细胞仪和MTT检测转染前后Mcl-1的蛋白表达差异以及细胞凋亡和生长活力变化。结果表明,USP9X在肝癌细胞SMMC7721和HepG2中的蛋白表达水平均高于正常肝细胞L02(t=15.155,P=0.000;t=9.171,P=0.001);SMMC7721和HepG2细胞中抑制USP9X能明显下调Mcl-1的蛋白表达,并导致细胞凋亡增加和生长活力降低。提示,肝癌细胞SMMC7721和HepG2中USP9X表达上调;USP9X表达降低可能通过下调Mcl-1的蛋白表达进而诱导人肝癌细胞SMMC7721和HepG2的凋亡。
- 胡惠雯汤成泳蒋清虎罗伟刘济铭魏续福刘锐吴忠均
- 关键词：原发性肝细胞肝癌细胞凋亡
- HBV人工转录因子的制备及其靶向抑制HBV增强子活性研究被引量：2
- 2014年
- 目的构建可靶向性识别HBV增强子的锌指蛋白人工转录因子真核表达载体,检测其在真核细胞内的表达、对细胞增殖影响及生物学活性分析。方法应用锌指蛋白(zinc finger protein,ZFP)设计工具Zinc finger tools 3.0获取人工转录因子(artificial transcription factor,ATF)结合结构域并融合抑制性效应结构域KRAB,全基因合成ATF克隆进真核表达载pcDNA3.1(+),酶切、测序来鉴定构建载体的正确性,X-tremeGENE HP转染pcDNA3.1-ATF于HepG2细胞,采用RT-PCR、免疫荧光及Western blot检测ATF mRNA与蛋白的表达情况;CCK-8检测不同浓度的ATF表达载体转染后对细胞增殖的影响;双荧光素酶报告基因检测ATF对HBV增强子序列的靶向性抑制作用。结果成功构建pcDNA3.1-ATF真核表达载体;在HepG2细胞中能够正常表达;CCK-8检测ATF对细胞增殖生长无明显的毒性作用;双荧光素酶报告基因分析ATF能靶向性结合增强子并抑制报告基因的表达。结论通过基因工程的方法构建pcDNA3.1-ATF的真核表达载体可正常表达且无明显细胞毒性作用,可靶向性识别HBV增强子并具有相应的生物学活性。
- 罗伟蒋清虎刘济铭胡慧雯温路魏续福刘锐吴忠均
- 关键词：增强子锌指蛋白人工转录因子真核表达载体
- HBV人工转录因子与拉米夫定抗HBV作用的比较研究被引量：3
- 2014年
- 目的构建特异性结合乙型肝炎病毒X基因启动子(Hepatitis B virus X promoter,HBV Xp)的人工转录因子真核表达载体,并与拉米夫定(3TC)体外抗乙肝病毒效果进行比较研究。方法利用Zine finger tools 3.0软件设计特异性结合HBV Xp的锌指蛋白(zinc finger protein,ZFP)并融合抑制性效应结构域kRAB,全基因合成后载入真核表达载体pc DNA3.1(+),构建重组质粒pc DNA3.1(+)-nls-ZFP-kRAB-Flag(ATF)、pc DNA3.1(+)-nls-ZFP-Flag(ZFP1)、pc DNA3.1(+)-nls-kRAB-Flag(ZFP2),通过酶切、测序鉴定重组质粒的正确性,Western blot和细胞免疫荧光鉴定重组质粒在Hep G2细胞表达情况。将重组质粒转染Hep G2.2.15细胞,设空白组(Blank组)、ATF组、ZFP1组、ZFP2组、空质粒组(Empty vector组)和拉米夫定组(3TC组),分别培养2、6、10 d,用Western blot、FQ-PCR、ELISA分别检测各组HBx蛋白、HBV DNA、上清中HBs Ag和HBe Ag的表达情况。结果重组质粒成功构建且能在Hep G2细胞中表达;ATF组抑制Hep G2.2.15细胞中X蛋白和HBV DNA的表达,与其余各组相比差异有统计学意义(P<0.05),且6 d和10 d抑制作用强于2 d;3TC组亦能抑制Hep G2.2.15细胞中X蛋白和HBV DNA的表达(P<0.05)。ATF组能抑制上清中HBs Ag,HBe Ag的分泌,与其余各组相比差异有统计学意义(P<0.05);3TC组亦能抑制上清中HBs Ag,HBe Ag的分泌(P<0.05)。结论人工设计的特异性ATF在真核细胞中能正常表达,并能有效发挥抑制HBV的作用,且抑制作用强于拉米夫定。
- 刘济铭陈聪罗伟蒋清虎胡惠文魏旭福刘锐吴忠均
- 关键词：锌指蛋白人工转录因子X蛋白HEPG2.2.15细胞
