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孔凡运: 作品数：13 被引量：20H指数：2; 供职机构：徐州医科大学更多>>; 发文基金：江苏省高校自然科学研究项目徐州市科技计划项目江苏省教育厅自然科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>

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初步探讨乙型肝炎病毒X蛋白激活PI3K／Akt信号通路对肝癌细胞增殖和迁移的影响被引量：2: 2012年; 目的探讨乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）激活磷脂酰肌醇-3-激酶／蛋白激酶B（P13K／Akt）信号通路对肝癌细胞增殖和迁移的影响。方法利用稳定表达HBx基因的肝癌细胞模型HepG2-HBX、Huh-7-HBX，运用阻断剂LY294002阻断P13K／Akt信号通路后，采用Westernblot方法分析HepG2-HBX和Huh-7-HBX细胞中P～Akt蛋白的表达水平的情况；采用CCK～8增殖实验和划痕愈合实验观测HepG2-HBX和Huh-7～HBX细胞的增殖和迁移能力。结果与阴性对照肝癌细胞相比，稳定转染HBx基因的肝癌细胞中的P—Akt蛋白的表达增多（P〈0．05），运用阻断剂LY294002阻断P13K信号通路后，稳定转染HBx基因的肝癌细胞内的P～Akt蛋白表达降低（P〈0．05）。CCK-8增殖实验和划痕愈合实验结果均显示，与阴性对照肝癌细胞相比，稳定转染HBx基因的肝癌细胞的增殖能力和迁移能力增加（P〈0．05）。经阻断剂LY294002阻断P13K／Akt信号通路后，稳定转染HBX的肝癌细胞的增殖和迁移能力减弱（P〈0．05）。结论HBx可通过激活19／3K／Akt信号通路促进肝癌细胞增殖和迁移。; 胡丽娜孔凡运尤红娟李向阳党景东刘雯汤仁仙郑葵阳陈明; 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白 PI3K/AKT 肝癌细胞增殖迁移

健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定: 2010年; 目的克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G(apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3G,APOBEC3G)基因cDNA,构建APOBEC3G基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定。方法采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因,将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒,并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞,经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果双酶切鉴定和测序结果表明,APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Western blot结果均显示,转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达,转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G,为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。; 甘宜敏孔凡运史震汤仁仙郑葵阳; 关键词：APOBEC3G 克隆真核表达载体

C端截断的HBX突变体通过上调DR4和DR5表达促TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡被引量：1: 2016年; 目的探讨不同的HBX截断突变体对TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5）表达的影响,以及DR4和DR5在HBX截断突变体增强TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡中的作用。方法构建HBX的1~120 aa（C端截断）、51~120 aa（C端和N端共同截断）和51~155 aa（N端截断）的突变体表达载体HBX1、HBX2和HBX3;在HepG2和Huh-7肝癌细胞中,Real-time PCR和Western blot检测稳定转染HBX不同突变体的DR4和DR5的表达;Western blot检测RNA小干扰载体（DR4-siRNA和DR5-siRNA）的HBX突变体的DR4和DR5表达情况,流式细胞术检测TRAIL（200 ng/ml）诱导的肝癌细胞凋亡情况。结果经PCR扩增和双酶切鉴定,3种突变体表达载体HBX1、HBX2和HBX3重组质粒构建成功,测序检测目的基因序列正确;Real-time PCR和Western blot表明,HBX1能显著增加2种肝癌细胞系中的DR4和DR5基因和蛋白的表达;而HBX2和HBX3对DR4和DR5基因和蛋白的表达无显著影响;在Hep G2-HBX1和Huh-7-HBX1细胞中,与对照组相比,DR4-siRNA和DR5-siRNA显著降低了DR4、DR5的表达;流式细胞术检测结果显示HepG2-HBX1和Huh-7-HBX1细胞的凋亡率较对照组细胞均显著提高;RNA小干扰抑制DR4和DR5的表达后,HepG2-HBX1和Huh-7-HBX1细胞的凋亡率下降。结论成功构建了3种不同HBX突变体的真核表达载体;HBX基因C端截断（1~120 aa）的突变体能够上调DR4和DR5的表达,且能够上调DR4和DR5的表达促进TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡。; 胡威魏肖周凯孔凡运寇艳波房贤达李向阳尤红娟郑葵阳汤仁仙; 关键词：肝癌细胞 DR4 DR5

特异性siRNA沉默LASP-1对HepG2细胞增殖和迁移的影响被引量：1: 2012年; 目的应用RNA干扰技术沉默细胞内LASP-1蛋白的表达,探讨LASP-1蛋白对人肝癌HepG2细胞增殖和迁移的作用。方法根据LASP-1 mRNA编码序列设计RNA干扰靶点并构建特异性小干扰RNA(siRNA),通过脂质体转染入HepG2细胞,采用Western blot法检测LASP-1蛋白的表达。采用CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell和划痕愈合实验方法,观察HepG2细胞增殖及迁移情况。结果 (1)LASP-1 siRNA对LASP-1蛋白表达水平有显著的下调作用(P<0.05)。(2)体外实验结果显示,与HepG2组及阴性对照组相比,siRNA组HepG2细胞增殖和克隆形成率明显被抑制(P<0.05),其迁移能力也下降(P<0.05)。结论下调LASP-1蛋白表达可显著抑制HepG2细胞的增殖和迁移能力,提示LASP-1在肝癌细胞恶性增殖和转移过程中具有重要作用,为临床上寻找抑制肝癌增殖转移的靶点提供新的思路和方法。; 孔凡运胡丽娜张海清李向阳尤红娟汤仁仙郑葵阳; 关键词：RNA干扰 HEPG2细胞增殖迁移

Sonic Hedgehog(SHH)促进胶原蛋白诱导关节炎大鼠滑膜成纤维细胞的增殖被引量：2: 2016年; 目的探讨Sonic Hedgehog(SHH)在滑膜成纤维细胞增殖中的作用。方法收集类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、强直性脊柱炎(AS)患者及健康正常人血清样本各(30例),ELISA检测上述血清SHH的含量。SD大鼠皮内注射2型胶原蛋白(Col2)诱导RA大鼠模型(CIA),取其滑膜组织原代培养滑膜成纤维细胞(SF)。免疫荧光细胞化学染色法检测vimentin表达鉴定SF,并检测SHH在SF中的表达。培养SF给予SHH-胶质瘤相关癌基因1(Gli-1)通路特异性阻断剂GANT61处理72 h,Western blot法检测SF表达SHH的变化情况,CCK-8法检测SF的增殖情况。结果 RA患者血清中SHH的含量较SLE、AS患者及正常组含量升高。成功建立CIA模型及分离培养SF;CIA-SF表达SHH较正常组SF高。给予GANT61处理72 h,CIA-SF中SHH蛋白表达降低且细胞增殖水平下降。结论 SHH参与RA发病与CIA-SF增殖有关。; 李慧秦苏萍孙德旭潘伟李向阳孔凡运郑葵阳汤仁仙; 关键词：滑膜成纤维细胞 SHH

APOBEC3G真核表达载体构建及抗HBV复制的初步研究被引量：1: 2010年; 目的构建人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)真核表达载体,并探讨其抗乙型肝炎病毒(HBV)复制的作用。方法采用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因编码区片段,构建pcDNA3.1-A3G真核表达载体,利用脂质体转染法将pcDNA3.1-A3G转染HepG2.2.15细胞,分别于转染后第24、48、72 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达情况。结果测序结果显示pcDNA3.1-A3G真核表达载体中APOBEC3G编码区序列存在1处碱基同义突变;HepG2.2.15细胞经APOBEC3G蛋白干扰后,HBx、HBsAg和HBeAg表达量逐渐降低,于72h表达量显著降低。结论成功构建了APOBEC3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G;APOBEC3G在体外可以抑制HBV复制,为深入研究APOBEC3G作为抗HBV药物提供了实验基础。; 汤仁仙甘宜敏孔凡运尤红娟史震胡丽娜郑葵阳; 关键词：真核表达载体 HEPG2.2.15细胞

融合型自杀基因系统Fcy：：Fur／5-FC对人肝癌细胞株HepG2体外杀伤作用的初步研究: 2011年; 目的研究融合型自杀基因Fcy：：Fur联合5-氟胞嘧啶（5-Fc）对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。方法应用脂质体介导法将Fcy：：Fur基因转染人人肝癌细胞株HepG2，经G418筛选2周后行有限稀释法获得稳定表达Fcy：：Fur基因的单克隆细胞。5-Fc处理后，通过MTF法和AnnexinV—FITC＋PI双标记染色法，检测Fcy：：Fur／5～FC自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的细胞增殖及凋亡的影响。结果MqT法检测显示稳定表达Fcy：：Fur基因的HepG2单克隆细胞经5-Fc处理后，在1、2、3、4、5天时对细胞的增殖有明显抑制作用。AnnexinV—FITC＋PI双标记染色法检测细胞凋亡率：1天为5．74％，2天为11．04％，3天为17．56％；PBS处理的细胞凋亡率：1天为3．67％，2天为3．68％，3天为4．42％，凋亡率无明显改变。结论Fcy：：Fur／5-FC自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的增殖有明显的抑制作用，并可促进肿瘤细胞凋亡。; 张海清周峰孔凡运李向阳史震孙伟郑葵阳汤仁仙; 关键词：肝癌

小鼠抗GBM肾炎模型的复制与鉴定被引量：4: 2011年; 目的为研究人类新月体性肾炎的发病机制,建立小鼠抗肾小球基底膜（GBM）肾炎的动物模型.方法 60只健康昆明小鼠随机分为肾炎模型组和正常对照组.肾炎模型组小鼠一次性尾静脉注射兔抗小鼠GBM血清（16 ml/kg）,正常对照组注射等量正常兔血清.肾炎模型组小鼠尾静脉注射兔抗小鼠GBM血清前1周,背部皮内注射正常兔血清进行预免疫.于兔抗小鼠GBM血清注射后第7、14、21、28天取尿液、血清、肾组织标本,检测尿蛋白、血肌酐、血尿素氮含量,观察肾组织病理变化.结果肾炎模型组小鼠注射兔抗小鼠GBM血清后,第2天蛋白尿、血肌酐和血尿素氮含量均明显升高,于第14天尿蛋白浓度达到高峰,而血肌酐和血尿素氮含量仍持续上升.肾炎模型组肾组织病理表现为：第7天大量炎症细胞浸润;第21天 GBM增宽增厚,足突融合,大量免疫复合物沉积,内皮细胞及系膜细胞显著增生,新月体形成.结论成功建立了小鼠抗GBM肾炎模型.; 李向阳孔凡运张海清汤仁仙郑葵阳; 关键词：抗GBM肾炎小鼠

特异性的shRNA抑制c－Jun蛋白表达对HepG2细胞增殖和迁移的影响: 2015年; 目的：构建c－Jun特异性的shRNA及研究其抑制c－Jun蛋白表达对人类肝癌细胞HepG2增殖和迁移的影响。方法根据c－Jun编码序列设计并构建shRNA质粒，利用LipofectamineTM 2000转染HepG2细胞，荧光显微镜观察转染效率。 Western blot检测其对c－Jun蛋白表达的影响。 CCK－8增殖实验、平板克隆形成实验观察HepG2细胞的增殖情况，transwell和划痕愈合实验方法观察细胞的迁移情况。结果构建了c－Jun小干扰质粒shRNA－1和shRNA－2。荧光显微镜观察到shRNA质粒在HepG2细胞转染效率约在80％。 Western blot显示shRNA－2小干扰质粒对c－Jun抑制效果要强于shRNA－1小干扰质粒。功能实验结果显示，与阴性对照组相比，shRNA－2能显著抑制HepG2细胞的增殖、克隆形成及其迁移能力（P均＜0．05）。结论成功构建了对c－Jun有效shRNA干扰质粒，下调c－Jun的表达能够明显抑制肝癌细胞的增殖和迁移，为进一步研究c－Jun在肝癌中的作用及相关机制提供了工作基础。; 罗文雅周凯胡磊李向阳孔凡运尤红娟汤仁仙; 关键词：HEPG2细胞增殖迁移

靶向HBX基因小干扰RNA抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究: 2010年; 目的探讨HBX特异性RNA小干扰抑制乙型肝炎病毒复制的作用。方法用脂质体转染法将干扰质粒pSilencer3.1-shHBX和通用阴性对照质粒分别转染HepG2.2.15细胞,并设立未转染的空白对照组。分别于转染后24、487、2 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA检测3组细胞上清中HBsAg和HBeAg表达情况。结果 Western blot检测显示,干扰质粒转染组HBx蛋白表达量逐渐降低,各时间点的表达量与空白对照组和通用阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01);ELISA检测显示,各时间点干扰质粒转染组细胞培养液上清中HBsAg和HBeAg的表达均下调,表达量与空白对照组和通用阴性对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论 HBX特异性小干扰RNA可抑制HBV复制,为siRNA作为抗乙肝病毒感染制剂提供了实验依据。; 汤仁仙孔凡运甘宜敏范宝峰尤红娟郑葵阳; 关键词：HBX 乙型肝炎病毒 HEPG2.2.15细胞

孔凡运

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