惠长野
- 作品数：11 被引量：19H指数：3
- 供职机构：南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 东亚钳蝎镇痛活性肽SAPⅢ的分离纯化、基因克隆与功能表达
- 目的:东亚钳蝎作为传统中药,镇痛功效显著。我们对东亚钳蝎蝎毒进行分离纯化和镇痛活性追踪,获得单组分镇痛活性多肽。对其进行结构解析,基因克隆,并应用原核表达技术进行功能表达。为镇痛的分子生物学机制研究和效果的进一步评价提供...
- 邵建华惠长野蔡启峰吴小燕顾兰兰吴春福张景海
- 关键词：东亚钳蝎活性肽可溶性表达镇痛
- 文献传递
- 乙型肝炎病毒感染HepG2细胞模型的构建被引量：3
- 2009年
- 目的:构建乙型肝炎病毒(HBV)感染的细胞模型。方法:将携带1.2拷贝HBV基因的重组腺病毒感染HEK293细胞进行包装、扩增并分离纯化。将扩增得到的HBV感染HepG2细胞,用ELISA法检测感染后第4天培养上清中的HBsAg,Real-time RT-PCR检测HBV mRNA。结果:ELISA检测结果显示,HepG2细胞感染HBV后上清液中HBsAg呈阳性。Real-time RT-PCR可以检测到HBV mRNA。结论:HBV能在HepG2细胞中表达复制和表达,HBV感染的HepG2细胞模型构建成功。
- 钟诚彭亮刘志华惠长野李珊凤曹虹
- 关键词：HEPG2细胞细胞模型
- 肠出血性大肠杆菌O157P:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究被引量：4
- 2009年
- 目的获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用。方法从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性。结果获得了大小约2805bp的eae片段;构建了重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面。结论高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础。
- 彭丽娟周勇杨瑜惠长野赵卫万成松
- 关键词：肠出血性大肠杆菌0157:H7EAE基因克隆免疫印记
- 东亚钳蝎抗神经兴奋肽表达、纯化及部分性质
- 对东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)同源性分析表明：ANEP与蝎昆虫抑制性神经毒素高度同源，ANEP应属于这一家庭，它们都作用于钠离子通道，是钠离子通道抑制剂。蛋白质同源建模软件WHAT－IF对ANEP 三维结构及二硫键进...
- 惠长野
- 关键词：分离纯化表达条件优化东亚钳蝎
- 文献传递
- shRNA表达载体构建及其对HBV体外抑制作用被引量：1
- 2010年
- 目的构建乙型肝炎病毒(HBV)基因X区和P区的shRNA表达载体,通过纳米聚合物将其转入HBV感染的细胞模型,并检测其对HBV复制的抑制作用。方法设计3条针对HBV基因编码区的干扰RNA序列,合成3对64nt的寡核苷酸,插入载体pRNAT-U6,构建重组干扰质粒Sl、S2和S3,利用纳米转染剂转入HBV感染的HepG2细胞。用实时荧光定量法检测HBVmRNA含量。结果干扰质粒S1、S2对HBv的复制有明显抑制作用,荧光定量检测转染后HBVmRNA表达水平发现,HBVmRNA含量分别减少至空白对照组的70.2%和61.2%,无关对照质粒则无抑制作用。结论成功构建针对HBv编码区的shRNA表达载体,并能在体外有效抑制HBVmRNA。
- 彭亮刘志华钟诚丁振华惠长野曹虹
- 关键词：RNA干扰乙型肝炎病毒
- 多表位HBV DNA疫苗的中试制备及质量研究被引量：1
- 2009年
- 目的建立多表位HBVDNA疫苗(PVAX-HS)的中试制备及质量控制方法。方法采用分批补料发酵方式,碱裂解结合超滤浓缩,三步柱层析制备DNA疫苗,并对终产品进行全面质量控制。结果分批补料发酵获得生物量50～60g/L,质粒最终产量约为1.0mg/g菌体,符合药用DNA疫苗质量标准。结论建立了质量稳定的PVAX-HS中试制备工艺,符合规模化生产要求。
- 郭妍惠长野
- 一种水相反应制备胰岛素衍生物的方法
- 2009年
- 目的建立一种简易的制备去B30及去B23-30肽胰岛素的方法。方法在转肽方法基础上,改变胰蛋白酶反应条件,在水相反应系统中,使得小C肽猪胰岛素原生成去B30及去B23-30肽胰岛素。阴离子交换层析进行产物分离,并结合HPLC纯度分析及质谱鉴定。结果胰蛋白酶催化猪胰岛素原生成去B30及去B23-30肽胰岛素。离子交换层析可以对两者进行基线分离。结论成功建立了一种制备胰岛素衍生物的方法,并对产物进行有效纯化。
- 惠长野
- 大肠杆菌外膜蛋白酶T及其突变体的表达、复性及生物活性分析被引量：5
- 2011年
- 外膜蛋白酶T(Outer-membrane protease T,OmpT)是定位于大肠杆菌外膜,具有高度底物特异性的蛋白水解酶。本文旨在建立克隆表达膜蛋白OmpT和体外复性的方法,考察其蛋白酶活性。首先以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增ompT基因,连接至pET28a(pET-ompT),引入点突变Asp85Ala,构建表达质粒pET-ompT85。然后将两种重组质粒转化入BL21(DE3),均以包涵体形式大量表达。纯化后的蛋白经稀释法复性,并加入粗制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)恢复蛋白酶活性。通过SDS-PAGE、鱼精蛋白水解试验及生长曲线观察表明,重组蛋白OmpT在体外能水解抗菌肽鱼精蛋白和兔肌肉肌酸激酶,而OmpT突变体则无上述功能。上述结果表明本文获得了具有蛋白水解酶功能的重组蛋白OmpT,该蛋白在体外可保护大肠杆菌抵抗鱼精蛋白的杀菌作用。
- 刘晓露惠长野赵铁彭亮张文炳黄胜和曹虹
- 关键词：大肠杆菌突变体生物活性
- 肠上皮细胞中大肠杆菌侵袭素IbeA结合蛋白的分离被引量：1
- 2009年
- 目的分离肠上皮Caco-2细胞中与IbeA相互作用的蛋白。方法表达并纯化重组IbeA,将1、5、10μg/ml的His-IbeA及牛血清白蛋白与Caco-2单层细胞4℃孵育30min后,在37℃利用庆大霉素保护实验测定各组大肠杆菌K1致病株E44侵袭率的变化。裂解Caco-2得全细胞蛋白,上样至结合有His-IbeA的金属离子螯和柱,His pull down纯化特异性结合蛋白,电泳分析,Far-Western blotting进行两者结合特异性的验证,并分析结合蛋白N末端氨基酸序列。结果重组IbeA阻断E44侵袭Caco-2,并呈一定剂量依赖关系,对照组BSA对侵袭没有显著影响。His pull down的方法纯化出两个结合条带,Far-Western blotting验证了结合的特异性。并测定强结合条带pI约5.0,N端序列为MASITKLP。结论分离得到两个与IbeA相互作用的蛋白,为研究IbeA分子致病机制奠定了基础。
- 惠长野郭妍李珺郝小燕曹虹黄胜和
- 关键词：CACO-2细胞结合蛋白纯化
- 大肠杆菌K1致病株外膜蛋白T体外功能被引量：8
- 2010年
- 纤溶酶原激活及水解抗菌肽利于致病菌侵袭及体内存活。【目的】构建大肠杆菌K1致病株E44的ompT基因缺失突变株,证实E44外膜蛋白T(OmpT)体外激活纤溶酶原及水解抗菌肽鱼精蛋白的活性。【方法】采用基因同源重组技术敲除大肠杆菌K1株E44中的ompT基因,构建ompT缺失突变株;二步柱层析纯化E44外膜组分,S-2251发色底物法测定其纤溶酶原激活活性;考察野生株E44、ompT基因敲除株E44ompT及转化带有ompT完整阅读框的质粒pUCT的E44ompT/pUCT三者对0.1mg/mL阳离子抗菌肽鱼精蛋白的敏感程度。【结果】利用自杀性载体pCVD442和同源重组的原理构建E44的ompT基因敲除株E44ompT;纯化得到约37kDa的E44外膜组分,S-2251发色底物法证实其具有纤溶酶原激活活性,纤溶酶原激活与膜组分的加入量呈一定量效关系;与野生株E44相比,ompT敲除株E44ompT对0.1mg/mL鱼精蛋白敏感,转化入带有ompT完整序列的质粒pUCT有一定的回补作用,E44ompT部分恢复抗鱼精蛋白能力。【结论】外膜蛋白T在致病株E44中有表达,并具有激活纤溶酶原及水解鱼精蛋白的活性。
- 惠长野郭妍吴书驰彭亮曹虹黄胜和
- 关键词：纤溶酶原鱼精蛋白
