方怡
- 作品数：46 被引量：143H指数：7
- 供职机构：上海交通大学医学院附属瑞金医院更多>>
- 发文基金：上海市科学技术委员会资助项目上海市自然科学基金安徽省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学化学工程更多>>
- 遗传性凝血因子XIII缺陷症分子机制的研究被引量：7
- 2003年
- 目的 研究两种遗传性凝血因子 (FXIII)A基因的缺陷 (FXIIIAArg77→Cys,Ser4 13→Trp)以了解其致病的分子机制。 方法 构建正常人FXIIIA重组表达质粒 (wt PCI/FXIIIA) ,通过定点突变获得上述 2种突变的FXIIIA重组表达质粒 (mut PCI/FXIIIA) ,并分别将它们转染到COS7细胞表达 ,PCR、RT PCR和Western印迹检测转染细胞中人FXIIIA的DNA水平、RNA水平及其蛋白质的表达量。用脉冲追踪试验追踪人FXIIIA蛋白在细胞内的变化。通过生物素化戊胺的掺入检测细胞内、外人FXIIIA的活性。结果 wt PCI/FXIIIA和mut PCI/FXIIIA稳定转染的COS7细胞内FXIIIA在RNA水平表达量相同 ;而两种mut PCI/FXIIIA转染的细胞内未检测到人FXIIIA蛋白质 ,且蛋白活性Ser4 13→Trp突变者仅为正常的 8.7% ,Arg77→Cys突变者则为 0 %。用脉冲追踪法显示正常FXIIIA蛋白质各时间点含量无减少 ,而两种突变的人FXIIIA在 0 .5h和 1h虽存在 ,但很快消失。结论 两种FXIIIA基因突变导致FXIIIA在细胞内不稳定 ,迅速被降解 ,从而FXIIIA蛋白量减少和活性丧失。
- 段宝华王鸿利王学锋胡翊群储海燕王红尹俊郭雪梅傅启华武文漫丁秋兰方怡王文斌周荣福康文英谢爽王振义
- 关键词：分子机制基因突变
- Glu29→Gly纯合子突变导致的遗传性凝血酶原缺乏症被引量：2
- 2003年
- 目的 对 1个遗传性凝血酶原缺乏症家系进行凝血酶原 (FⅡ )基因突变的检测。方法 用活化的部分凝血活酶时间 (APTT) ,凝血酶原时间 (PT)及FⅡ促凝活性 (FⅡ∶C)、FⅡ抗原 (FⅡ∶Ag)测定进行表型诊断 ;用PCR法对先证者的FⅡ基因 14个外显子及其侧翼序列和 5′端非翻译区 (5′UTR)、3′端非翻译区 (3′UTR)序列进行扩增 ,PCR产物纯化后直接测序 ,检测其基因突变。家系成员DNA在先证者FⅡ基因突变区域扩增后测序。突变位点经限制性内切酶分析证实。 10 3名健康献血者作对照。结果 先证者表型诊断为凝血酶原缺乏症 (Ⅰ型 ) ;FⅡ外显子区共发现 3个与文献报道的FⅡ基因序列不同的位点 ,其中位于第 2外显子区的为纯合突变A6 0 1G。家系分析表明先证者父亲、母亲和外祖母均为A6 0 1G杂合子。结论 纯合错义突变A6 0 1G引起的Glu2 9→Gly是导致该例遗传性凝血酶原缺乏的原因。
- 王文斌王鸿利黄成垠方怡傅启华周荣富谢爽丁秋兰武文漫王学锋胡翊群王振义
- 关键词：基因突变聚合酶链反应
- 人凝血因子ⅧcDNA在小鼠体内的转染与表达被引量：3
- 2004年
- 本研究观察逆转录病毒载体和聚酰胺 胺型 (PAMAM)树枝状聚合物介导的人凝血因子Ⅷ (FⅧ )基因在小鼠体内的转染和表达 ,并与体外转染方法作比较。应用含B区缺失 ( 76 0aa- 16 39aa)人FⅧcDNA(FⅧBDcDNA)的以逆转录病毒为框架的重组表达质粒载体 pLNC FⅧBD包装成为逆转录病毒LNC FⅧBD ,exvivo转染小鼠骨髓基质细胞 ,同时将 pLNC FⅧBD与PAMAM树枝状聚合物按照 1∶15混合以形成复合体PAMAM pLNC FⅧBD进行小鼠invivo转染。分别于注射后第 2 4 ,4 8小时 ,第 1,2 ,3,4周取血 ,分离血浆 ,采用一期法测定人FⅧ活性 (FⅧc) ,ELISA法测定人FⅧ抗原 (FⅧAg) ,并采用Bethesdainhibitorassay测定人FⅧ抗体 ;同时取脏器肝、脾、肺、肾提取RNA ,进行RT PCR ,观察各组织的转录 ,并用苏木素 伊红染色法观察各组织的形态学改变。结果表明 ,逆转录病毒转染人FⅧ基因的骨髓基质细胞输入体内后 ,可以在体内继续表达人FⅧ ,并且能有效地分泌至血液中。宿主小鼠体内可检测到的人FⅧ表达持续 3周以上 ,注射后第 2 4小时表达最高水平 ,人FⅧAg平均为 8.6ng/ml,此后人FⅧ抗体逐渐生成 ,人FⅧAg水平渐低 ,于注射后第 4周不再能测出人FⅧAg。注射复合体PAMAM pLNC FⅧBD在体内转染后 ,获得了短暂的人FⅧ生理水平的表达 ,在注射?
- 康文英王鸿利王红王学锋王从珠傅启华丁秋兰武文漫方怡王振义
- 关键词：逆转录病毒基因治疗
- 完善血友病基因诊断体系
- 王学锋戴菁陆晔玲蔡晓红方怡丁秋兰王鸿利
- 遗传性凝血因子缺陷症分子发病机制研究
- ＜正＞ 目的研究无纤维蛋白原（Fg）血症、凝血酶原（FⅡ）、凝血因子Ⅴ（FⅤ）、凝血因子Ⅶ（FⅦ）、凝血因子Ⅷ（FⅧ,血友病）、血管性血友病因子（vWD）、凝血因子Ⅸ（FⅨ,血友病B）、凝血因子Ⅹ（FⅩ）、凝血因子Ⅺ（F...
- 王鸿利王学锋丁秋兰刘湘帆傅启华武文漫段宝华王文斌方怡王振义
- 文献传递
- 直接核酸测序法进行血友病A携带者及产前诊断被引量：3
- 2003年
- 目的:对一血友病A(HA)家系进行携带者及产前诊断。方法:用活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(Fg)和血浆因子Ⅷ促凝活性(FⅧ:C)测定进行表型诊断;用FⅧ内含子22倒位直接检测以及FⅧ基因内外4个位点的多态性进行遗传连锁分析;用核酸直接测序法对FⅧ各外显子及其侧翼序列进行检测。结果:表型检测证明先证者为重型HA,其妹妹FⅧ:C正常;FⅧ内含子22倒位直接检测及FⅧ基因内外4个位点的多态性遗传连锁分析均未获得有诊断意义的信息;直接核酸测序证实先证者及其妹妹FⅧ基因24号外显子第2209位氨基酸存在Arg→Gln(CGA→CAA)错义突变,酶切结果与此一致,其妹为携带者,后者胎儿羊水细胞DNA检测为正常男性。结论:FⅧ基因24号外显子错义突变Arg2209Gln(CGA→CAA)是该HA先证者发病的分子机制。此突变位点为国内首次报道,且该家系为国内首例运用直接核酸测序法进行HA携带者及产前诊断的家系。
- 戴菁王学锋傅启华方怡武文漫丁秋兰王鸿利
- 关键词：血友病A携带者产前诊断
- 一个纤维蛋白原γ链Arg275His突变导致的遗传性异常纤维蛋白原血症家系被引量：28
- 2005年
- 目的 对一个遗传性异常纤维蛋白原血症家系进行表型和基因型分析。方法 采集家系3代5人外周血,吸取上层血浆用血凝仪检测活化部分凝血酶原时间、凝血酶原时间、凝血酶时间、蛋白C活性、蛋白S活性和抗凝血酶活性,纤维蛋白原活性和抗原分别用Clauss法和免疫比浊法进行检测。以常规酚-氯仿法抽提家系所有成员外周血基因组DNA,PCR扩增纤维蛋白原基因FGA、FGB和FGG所有外显子及其侧翼序列,PCR产物纯化后直接测序以检测基因突变。结果 先证者活化部分凝血酶原时间、凝血酶原时间正常,凝血酶时间超出正常上限值2倍以上,纤维蛋白原活性明显下降,抗原也低于正常范围,且活性显著低于抗原;其母表型检测结果与之相似。基因分析显示先证者呈纤维蛋白原FGG基因第8外显子g.5 6 78G>A杂合碱基置换,导致Arg2 75 His错义突变,该突变来源于母系。结论 纤维蛋白原γ链Arg2 75 His杂合错义突变是引起该家系异常纤维蛋白原血症的原因。
- 方怡王学锋傅启华武文漫丁秋兰戴菁周荣富王文斌谢爽王鸿利
- 关键词：家系活化部分凝血酶原时间CLAUSS法纤维蛋白原基因抗凝血酶活性蛋白C活性
- 一例血友病A家系中女性患者的双重杂合突变的基因分析
- 目的:血友病A(hemophilia A,HA)是最常见的一种X连锁隐性遗传性出血性疾病,在男性群体中的发病率为1/5000,约占血友病的80%～85%。该病的发病机制除了内含子22及1倒位以外,主要为各种点突变。本文对...
- 蔡晓红王学锋戴菁方怡丁秋兰王文斌谢飞谢爽王鸿利
- 文献传递
- 纤维蛋白原Bβ链复合杂合突变导致的遗传性无纤维蛋白原血症
- 目的:纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)是由Aα、Bβ、γ三条多肽链为组分,以链间二硫键相连构成的对称性二聚体(Aa、Bβ、γ)。其中三条多肽链分别由三个独立基因FGA、FGB、FGG编码,集中于4q28～4q31...
- 方怡王鸿利王学锋傅启华王文斌谢爽周荣富戴菁王振义
- 文献传递
- 纤维蛋白原Ββ-链复合杂合突变导致的遗传性无纤维蛋白原血症被引量：3
- 2005年
- 遗传性无纤维蛋白原血症是一种由于纤维蛋白原基因缺陷所致常染色体隐性遗传病。为了对1例遗传性无纤维蛋白原血症家系进行表型和基因型分析,采集了该家系三代10人外周血,吸取上层血浆用血凝仪检测活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT);纤维蛋白原(Fg)含量分别用Clauss法和免疫比浊法进行检测;以常规酚氯仿法抽提家系所有成员外周血基因组DNA,PCR扩增Fg基因FGA、FGB和FGG所有外显子及其侧翼序列和启动子区,PCR产物纯化后直接测序以检测基因突变。102例健康献血者作为正常对照。结果表明:先证者表型诊断为无纤维蛋白原血症;基因型呈FgΒβ链Arg17stop和Gly347Arg复合杂合突变,前者来源于母系,后者来源于父系。结论:FgΒβ链Arg17stop和Gly347Arg复合杂合突变是引起该家系先证者产生无纤维蛋白原血症的原因。
- 方怡王鸿利王学锋傅启华王文斌谢爽周荣富戴菁王振义
- 关键词：纤维蛋白原基因突变
