曾献武
- 作品数：27 被引量：35H指数：4
- 供职机构：成都生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金“重大新药创制”科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学理学更多>>
- 一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应用
- 本发明公开了一种乙脑/黄热嵌合病毒的cDNA克隆，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明还公开了乙脑/黄热嵌合病毒及其应用，以及一种预防黄热病的疫苗。本发明嵌合病毒Chimeri-JYF的毒性小，免疫保护作用好...
- 杨会强汪伟何婷刘莉娜赵宇刘俐曾献武
- 登革病毒1型E蛋白的原核细胞表达及多克隆抗体的制备被引量：1
- 2013年
- 目的构建登革病毒1型(DENV-1)E蛋白的原核细胞表达载体并进行原核细胞表达,并制备其多克隆抗体。方法利用聚合酶链反应(PCR)扩增DENV-1E蛋白序列,经酶切后将其插入原核细胞表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32-D1-E。重组质粒转化E.Coli Rosetta(DE3)感受态细胞,目的蛋白经异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,纯化后采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步分析蛋白表达情况,并用纯化后的表达蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗血清,用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性。结果成功构建了pET-32-D1-E原核细胞表达重组质粒,DENV-1E蛋白获得高效表达;纯化后的重组蛋白免疫家兔获得的特异性抗血清效价为1∶25 600,Western blot证实其特异性良好。结论成功构建了DENV-1E蛋白的原核细胞表达载体,并制备了可用于DENV快速检测的高效多克隆抗体。
- 汪伟丁显平杨会强李竹石谭帅赵宇刘莉娜谭昌耀曾献武
- 关键词：登革病毒原核细胞
- 治疗用卡介苗在膀胱癌预防及治疗中的作用被引量：2
- 2019年
- 目的探讨治疗用卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin vaccine for treatment,BCGt)在膀胱癌预防及治疗中的作用。方法MB49细胞灌注小鼠膀胱,建立小鼠原位膀胱癌模型,进行BCGt预防性和治疗性试验,观察小鼠生存情况。末次治疗后第6天,经小鼠眼球采血,检测血清中IgG、IFNγ和IL-6的含量,同时取小鼠脾脏,检测特异性T淋巴细胞;每次治疗后检测小鼠尿液中一氧化氮(NO)含量;末次治疗45 d后进行记忆性免疫试验。结果成功建立了基于MB49细胞的小鼠原位肿瘤模型,致癌率100%。BCGt免疫预防和治疗两种方式均可延长小鼠的生存期;BCGt治疗后小鼠血清中的IgG、IFNγ、IL-6及尿液中NO含量明显升高(P<0.05),特异性T淋巴细胞反应明显增强(P<0.001),且可产生免疫记忆。结论BCGt具有预防及治疗膀胱癌的作用,且BCGt抗肿瘤作用可能是通过产生IFNγ、IL-6、NO等发挥作用的。
- 唐溯刘菊刘菊徐永革徐永革曾献武陈佩陈佩巩迪潘海龙
- 关键词：膀胱癌细胞毒性免疫应答
- 寨卡病毒E蛋白第三结构域的可溶性表达及多克隆抗体的制备
- 2019年
- 目的原核表达并纯化寨卡病毒(Zika virus)E蛋白第三结构域(ZK-EⅢ)重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增ZK-E Ⅲ序列,经双酶切后将其插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-ZKE Ⅲ,转化至大肠埃希菌(E. coli)Rosetta2(DE3),经IPTG诱导,表达的重组蛋白经亲和层析和阴离子交换层析纯化后,免疫家兔,制备ZK-E Ⅲ多克隆抗血清,进行Western blot鉴定后,ELISA法检测该抗血清效价。结果经PCR及测序鉴定证明原核表达质粒pET-ZKE Ⅲ构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约31 000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的60%;用纯化的重组蛋白免疫家兔后,获得的血清特异性良好,血清效价为1∶51 200。结论 ZKE Ⅲ蛋白在E. coli中以可溶性形式表达,制备的抗血清特异性好,效价高,具有用于寨卡病毒诊断和进行重组亚单位疫苗开发的潜力。
- 何婷杨欢范凤鸣刘杰牟建超孙艳陈智代云见曾献武杨会强
- 关键词：原核表达多克隆抗体
- 四川地区结核分枝杆菌喹诺酮耐药基因突变研究被引量：8
- 2004年
- 目的 研究结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物的分子机制 ,探索四川地区耐喹诺酮结核分枝杆菌临床分离株的耐药基因突变特征。方法 采用绝对浓度法检测结核分枝杆菌临床分离株的最小抑菌浓度 (MIC) ,再通过聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR- SSCP)和直接测序检测结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物临床分离株 gyr A耐药决定区 (QRDR)突变 ,并和标准株 H 37Rv比较。结果 6 8株临床分离株中 ,14株喹诺酮药物敏感株和 8株低耐药株未发现 gyr A耐药决定区基因突变 ,2 5株高耐药株、11株低耐药株和 10株药物敏感株检测到 gyr A基因突变 ,高耐药株突变率为 10 0 % ,低耐药株突变率为 5 8% ,敏感株突变率为 4 2 % ,总的突变率为 6 8%。根据 SSCP条带 ,gyr A突变可分成 4种类型 ,测序发现分别为 Ser95 Thr、Asp94 Gly、Ala90 Val、Ala83Val突变。结论 结核分枝杆菌耐喹诺酮与 gyr A基因突变密切相关 ,gyr A基因突变是耐喹诺酮结核分枝杆菌耐药性的主要分子机制。
- 赵明才鲍朗吴悦涵龙洋曾献武张会东谢益新
- 关键词：结核分枝杆菌聚合酶链反应-单链构象多态性
- 结核分枝杆菌Rv0901基因原核表达质粒的构建及其表达
- 2004年
- 目的 为研究结核分枝杆菌基因Rv0 90 1的功能提供材料。方法 PCR扩增Rv0 90 1基因编码序列 ,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX 1λT获得重组表达质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,通过SDS PAGE、GST 纯化试剂盒鉴定并纯化表达产物。结果 从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv0 90 1基因 ;成功构建了融合表达质粒pGEX Rv0 90 1;重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 4 5kDa的GST Rv0 90 1融合蛋白。结论 本实验成功表达并纯化GST Rv0 90 1融合蛋白 ,为Rv0 90 1基因功能的研究打下了基础。
- 吴悦涵鲍朗赵明才龙洋曾献武张会东
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达质粒基因表达重组质粒
- 无小鼠神经毒力的乙型脑炎病毒／登革病毒1型嵌合病毒的筛选与序列分析
- 2018年
- 目的采用蚀斑纯化法筛选对小鼠无神经毒力的乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）／登革病毒（denguevirus，DENV）1型嵌合病毒（JD1）纯化株，分析影响JD1小鼠神经毒力的相关位点。方法将JD1在乳地鼠。肾细胞中进行3轮蚀斑纯化，检测JD1纯化株对小鼠的脑内神经毒力。然后提取无神经毒力纯化株的基因组RNA，用逆转录PCR分段扩增全基因组序列并进行序列测定。将测序结果分别与原DENV-1的前膜-包膜蛋白和JEV骨架病毒株SA-14-14-2的基因序列进行比对。选取2个无神经毒力纯化株进行小鼠免疫保护实验。采用单侧￡检验对结果进行比较。结果经过3轮蚀斑纯化后，获得大、中、小3种蚀斑形态的6个JD1纯化株。3个纯化株对小鼠无神经毒力，小鼠脑内注射后全部存活；1株神经毒力较弱，70％以上小鼠存活；2株具有强神经毒力，小鼠全部死亡。测序结果显示，对小鼠无神经毒力的3个纯化株存在2处相同的氨基酸突变。将其中2个纯化株JD1-PP-61和JD1-PP-31腹腔免疫小鼠后，再用1000半数致死量DENV-1鼠脑适应株进行脑内攻击。JD1-PP-61能较好地保护小鼠抵抗病毒攻击，仅20．0％小鼠死亡（t=7．237，P〈0．001）；JD1-PP-31保护效果稍弱，41．9％小鼠死亡（t=4．752，P〈0．01）。结论通过蚀斑纯化筛选出对小鼠无神经毒力的JD1纯化株，并发现了可能与神经毒力减弱相关的位点。
- 何婷范凤鸣牟建超杨欢刘莉娜刘俐汪伟曾献武杨会强
- 关键词：登革热病毒脑炎病毒神经毒力
- 乙脑/登革2型嵌合病毒的构建及其作为疫苗候选株的初步检定
- 2018年
- 目的构建以乙脑疫苗株SA14-14-2为基因骨架的乙脑/登革2型嵌合病毒,并进行初步检定,分析其作为疫苗候选株的可行性。方法用登革病毒(dengue virus,DENV)减毒株PDK53 prME基因替换乙脑病毒疫苗株SA14-14-2的相应区域,构建乙脑/登革2型嵌合病毒全长克隆质粒,通过体外转录、转染原代地鼠肾(PHK)细胞,拯救出乙脑/登革2型嵌合病毒,并分析该嵌合病毒的蚀斑特征、增殖特征、神经毒力和神经侵袭力、免疫原性及免疫攻击保护作用。结果构建的嵌合病毒比乙脑疫苗株SA14-14-2具有更小的蚀斑,在PHK细胞上具有更低的增殖能力;对成鼠无神经毒力和神经侵袭力;可诱导小鼠产生较高的中和抗体效价,且免疫8周后,中和抗体滴度无明显下降(P> 0. 05);能保护小鼠免受致死剂量DENV的脑内攻击。结论本实验制备的嵌合病毒具有良好的安全性、免疫原性及免疫保护作用,有望作为登革疫苗候选株。
- 牟建超范凤鸣陈智冯劲松何婷杨欢杨会强曾献武刘杰
- 关键词：乙型脑炎病毒登革病毒神经毒力免疫保护
- 登革病毒1型E蛋白第三结构域的原核表达及其免疫原性
- 2014年
- 目的在大肠埃希菌中表达登革病毒(Dengue virus,DENV)1型(DENV-1)E蛋白第三结构域(EⅢ),并分析重组蛋白的免疫原性。方法利用PCR技术从质粒p MD-D1pr M/E中扩增DENV-1的EⅢ序列,插入原核表达载体p ET-32a(+),构建重组表达质粒p ET-D1EⅢ,转化至E.coli Rosetta2(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经亲和层析和阴离子交换层析纯化后,免疫家兔,制备多克隆抗体,采用Western blot法检测抗体的特异性,间接ELISA法检测抗体滴度,蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)检测中和抗体效价。用纯化的重组蛋白免疫经腹部皮下多点注射BALB/c小鼠3次,末次免疫2周后,用DENV-1(Hawaii株)经脑内攻击,分析重组蛋白对小鼠的免疫保护力。结果重组原核表达质粒p ET-D1EⅢ经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为33 000,主要以可溶性形式表达,占重组菌裂解上清蛋白量的52.37%;纯化的纯度可达90%以上,浓度达2 mg/ml;制备的多克隆抗体特异性强,效价高;重组蛋白能保护57.1%的小鼠免受致死剂量DENV的攻击。结论成功在E.coli Rossetta2(DE3)中高效表达了DENV-1 EⅢ蛋白,纯化的重组蛋白免疫家兔获得的多克隆抗体具有较强的特异性和较高的效价,且在小鼠免疫保护试验中显示出较好的保护力。本实验为进一步研究E蛋白的功能和登革新型疫苗的开发奠定了基础。
- 汪伟李竹石谭帅赵宇刘莉娜刘俐蔡峰曾献武杨会强
- 关键词：登革病毒E蛋白原核细胞免疫原性免疫保护力
- 登革病毒3型E蛋白的原核表达及抗体的制备被引量：2
- 2013年
- 目的原核表达并纯化登革病毒3型（DENV-3）E蛋白，并用于制备其抗体。方法采用PCR技术克隆DENV-3E蛋白基因，插入原核表达质粒载体pET-32a（＋），转化大肠杆菌RoseRa（DE3），IPTG诱导表达。表达产物经纯化后，免疫家兔，制备DENV-3E蛋白抗血清，并用于Westernblot鉴定。同时，采用ELISA测定其抗体效价，并初步应用于DENV-3的检测。结果重组表达载体经双酶切及测序证实构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为65×103，主要以包涵体形式表达；用纯化的包涵体蛋白免疫家兔后，获得的特异性抗血清效价为1：20480，该血清可与DENV-3发生特异性反应。结论本研究原核表达并纯化了DENV-3E蛋白，制备了高滴度的特异性兔抗血清。制备获得的DENV-3E蛋白抗体可用于登革病毒的鉴定，为登革病毒相关研究奠定了基础。
- 林华杨会强李竹石杨健赵宇刘俐葛永红曾献武曹毅乔代蓉李玉华
- 关键词：登革病毒E蛋白原核表达多克隆抗体
