李山虎
- 作品数：47 被引量：60H指数：5
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划军队科研计划项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学化学工程更多>>
- 用Red介导的同源重组结合酶切改构质粒DNA
- 2005年
- 目的:用Red介导的单链寡核苷酸体内同源重组结合限制酶切方法对pBR322-Red质粒中的DNA序列进行精确的缺失突变。方法:用合成的单链寡核苷酸打靶分子电击转化W3110(pBR322Red)宿主菌,利用Red提供的同源重组功能敲除从kil基因至N基因长约2100bp的DNA序列,并用kilN序列中含有的单一酶切位点XhoⅠ对混合质粒进行酶切,取酶切产物转化W3110感受态细胞,菌落PCR方法筛选重组阳性克隆。结果:在没有任何筛选标记的情况下,用菌落PCR方法从10个菌落中成功挑选出1个重组阳性克隆。结论:该方法操作简单、精确,能够避免引入新突变,为DNA序列的缺失突变提供了一种新方法。
- 于梅李山虎陈伟周建光
- 关键词：同源重组缺失突变寡核苷酸类
- 4E-BP1、4E-BP1-4A重组慢病毒载体的构建及对胃癌细胞HGC27生长的影响被引量：1
- 2013年
- 目的:构建4E-BP1及其T37A、T46A、S65A、T70A突变体4E-BP1-4A基因表达的重组慢病毒载体,研究其对胃癌HGC27细胞生长的影响。方法:PCR扩增4E-BP1基因及其突变体4E-BP1-4A基因并克隆到pCDH载体,构建成pCDH-4E-BP1、pCDH-4E-BP1-4A,将其与包装载体共转染293T细胞,包装成Lenti-4E-BP1及Lenti-4E-BP1-4A重组慢病毒载体,将此慢病毒感染胃癌HGC27细胞,Western印迹鉴定病毒载体介导的4E-BP1、4E-BP1-4A蛋白的表达,MTT、克隆形成和软琼脂方法研究过量表达4E-BP1、4E-BP1-4A对胃癌HGC27细胞生长的影响。结果:包装成Lenti-4E-BP1及Lenti-4E-BP1-4A重组慢病毒载体,并将此慢病毒载体感染胃癌HGC27细胞;MTT、克隆形成、软琼脂实验表明过量表达4E-BP1可抑制胃癌HGC27细胞的生长,过量表达4E-BP1-4A时抑制效果更明显。结论:构建了4E-BP1、4E-BP1-4A的重组慢病毒表达载体,在胃癌HGC27细胞中过量表达4E-BP1可抑制细胞生长,过量表达4E-BP1-4A的抑制效果更明显。
- 罗国兰王洪涛伍飞马李海量张晓清薛萌王健李山虎赵亚丽刘萱周建光
- 关键词：慢病毒载体胃癌细胞生长
- 敲低前列腺癌相关基因PC-1的表达抑制前列腺癌细胞C4-2雄激素非依赖性生长
- 2010年
- 目的:研究敲低癌基因D52家族成员PC-1的表达对前列腺癌细胞雄激素非依赖性生长的影响。方法:利用RNA干扰技术构建PC-1稳定低表达的C4-2细胞株;利用四唑盐(MTT)比色实验检测敲低PC-1基因表达对C4-2细胞雄激素非依赖生长的影响。结果:敲低PC-1表达抑制前列腺癌C4-2细胞的生长,并降低了C4-2细胞雄激素非依赖性生长的能力。结论:PC-1基因参与了前列腺癌向雄激素非依赖阶段发展和维持的过程,为进一步研究PC-1在促进前列腺癌细胞发生发展过程中的作用奠定了基础。
- 俞岚钱晓龙施庆国李山虎王洪涛王乐乐周建光
- 关键词：前列腺癌RNA干扰
- 端粒酶反义寡核苷酸对膀胱癌T24细胞的作用被引量：4
- 2001年
- 目的 探讨全硫代修饰的端粒酶反义寡核苷酸 (ASODN t)抑制人膀胱癌T2 4细胞增殖并诱导其凋亡的可能性 ,为膀胱癌基因治疗提供新靶点。方法 采用光镜、电镜、四唑盐比色(MTT)法及流式细胞术等检测不同浓度 (2～ 10 μmol/L)ASODN t对T2 4细胞生长、细胞周期和诱导其凋亡的作用。结果 不同浓度ASODN t对T2 4细胞生长有抑制作用 ,且具有序列特异性及剂量依赖性 ,6μmol/lASODN t作用细胞 72h ,电镜观察可见典型凋亡特征 ,流式细胞仪检测到凋亡峰 ,凋亡率为 10 .4% ,而无关寡核苷酸 (N ODN )则无此作用。结论 ASODN t对T2 4细胞生长有抑制作用 ,可诱导其发生凋亡 ,说明端粒酶与T2 4细胞恶性增殖有关 。
- 符伟军邵国兴黄君健王禾徐兵李山虎
- 关键词：端粒酶脱噬作用反义寡核苷酸T24细胞
- 人4型腺病毒拷贝数SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法的建立被引量：1
- 2017年
- 目的:建立检测人4型腺病毒拷贝数的荧光定量PCR方法。方法:提取本实验室构建的4型腺病毒全基因组质粒,以梯度稀释质粒为标准模板,选取人4型腺病毒六邻体区域基因设计一对特异性引物,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线。结果:标准曲线为y=-4.284x+53.468,由全基因组质粒所构建的标准曲线线性关系良好,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系(R2=0.999 609),检出敏感度可达1×102拷贝/μL,且与其他几种腺病毒无交叉反应。用该方法检测4型腺病毒感染细胞2、12和24 h后的病毒拷贝数,其病毒拷贝数随时间增加,与细胞病变(CPE)变化保持一致,且荧光定量PCR的测量结果稳定(变异系数<6%)。结论:建立了检测人4型腺病毒基因拷贝数的荧光定量RT-PCR方法,该方法灵敏度高、特异性强。
- 张文宁王芃周建光王健秦崇涛李宗李山虎
- 关键词：实时荧光定量PCR
- PC-1在前列腺癌细胞中促进c-myc基因的表达被引量：2
- 2010年
- 前列腺癌相关基因PC-1(Prostate and colon gene1)是属于癌基因D52家族成员,具有促进前列腺癌细胞雄激素非依赖性生长的功能。为了研究PC-1发挥这种生物功能的分子机制,文章在PC-1高表达的LNCaP-pc-1及对照LNCaP-zero细胞中,利用RT-PCR和Western blotting等方法检测c-myc基因表达;提取两细胞胞质和胞核蛋白,利用Western blotting分析c-myc上游调节蛋白β-catenin变化;利用c-Myc蛋白抑制剂10058-F4作用前列腺癌细胞C4-2,Western blotting检测PC-1蛋白表达变化。发现PC-1促进c-myc基因表达,并促进β-catenin入核;c-Myc蛋白抑制剂10058-F4可抑制PC-1的表达。结果表明:PC-1在前列腺癌中促进c-myc基因的表达,并且这种促进作用可能是通过Wnt/β-catenin信号通路实现的。同时,PC-1与c-Myc蛋白间可相互促进,进一步促进前列腺癌细胞雄激素非依赖性生长。
- 俞岚施庆国钱晓龙李山虎王洪涛王乐乐周建光
- 关键词：前列腺癌C-MYC基因Β-CATENIN蛋白
- boxA及上游序列缺失突变对λ噬菌体抗转录终止功能的影响
- 2003年
- 目的 研究λ噬菌体表达调控机理 ,阐明PL操纵子boxA及邻近序列突变对抗转录终止作用的影响。方法 利用体内同源重组技术 ,使大肠杆菌染色体DNA上携带了CI85 7,PL ,nutL[box A ( 代表不同的boxA及临近序列缺失突变 )、boxB],N lacZ ,ttt,galK单拷贝基因 ,构建了含boxA及邻近序列突变 (boxA )的一系列新菌株 ,模拟了λ噬菌体感染宿主菌后的生理状态 ,利用抗转录终止报道基因galK分析研究了boxA及临近序列突变对PL操纵子抗转录终止作用的影响。结果 证明在缺失了boxA及部分上游序列的情况下 ,大肠杆菌RNA聚合酶不能通读转录终止子。结论 λ噬菌体左向操纵子具有与右向操纵子不同的转录调控现象。
- 李山虎周建光洪鑫黄君健李杰之黄翠芬
- 关键词：Λ噬菌体基因突变真核细胞基因表达调控
- 一种可转移的重组工程系统pYM-Red的建立被引量：4
- 2005年
- 重组工程是近几年发展的新型遗传工程技术.以PCR扩增的线性低拷贝质粒pACYCl84为载体,用Gap-repair方法从大肠杆菌DY330染色体上直接体内亚克隆了包括Red重组酶基因在内的长约6.7kb的基因序列,构建了pYM-Red重组质粒.在宿主菌W3110体内进行了染色体上galk基因的敲除,验证了Red重组酶的生物功能,并确定了影响pYM-Red重组效率的诱导时间和线性DNA片段用量.在42℃诱导10 min和线性DNA打靶分子浓度为300 ng时,pYM-Red的重组效率可达到大约每4 000个电转存活细胞中有1个重组阳性克隆,分别比pKD46和pBR322-Red系统高5～6倍.
- 于梅周建光陈伟李山虎黄翠芬
- 关键词：RED重组系统
- 应用Red重组工程技术在大肠杆菌外膜展示表达外源蛋白
- 2008年
- 目的将外源蛋白或抗原稳定表达展示于大肠杆菌的外膜上。方法应用大肠杆菌DY330介导的重组工程系统和kan/sacB无痕迹修饰技术，将长度为1653 bp的荧光素酶报告基因（luc）敲入DY330染色体与外膜蛋白基因lpp、ompA融合。结果报告基因定量分析结果证明：外源荧光素酶（1uciferase，Luc）能够与外膜蛋白融合表达于细菌外膜，Lpp-OmpA-Luc融合蛋白表达于细菌外膜的效率最高。结论外源蛋白能够稳定表达于细菌外膜，不会影响细菌的生长繁殖。
- 李山虎施庆国黄翠芬周建光
- 关键词：同源重组荧光素酶报告基因外膜蛋白
- 重组酶Exo的纯化及多克隆抗体制备
- 2010年
- 目的:纯化Exo重组酶融合蛋白并制备相应抗体。方法:用阴离子交换柱对蛋白进行初步纯化,然后用Ni-NTA介质填充的层析柱分离纯化含His标签的融合蛋白,用谷胱甘肽琼脂糖4B介质填充的层析柱分离纯化GST融合蛋白;二次纯化的蛋白利用硝酸纤维素膜结合法制备抗原蛋白并免疫实验动物。结果:ELISA结果显示血清抗体效价可达到1∶12 800,说明通过Western免疫印迹自制的多克隆抗体能特异地与Exo重组蛋白相互作用。结论:该蛋白纯化方法操作简单,制备的抗原纯度高,多克隆抗体特异性好。
- 施庆国李山虎钱晓龙周建光
- 关键词：蛋白纯化多克隆抗体制备
