付朋飞 作品数:35 被引量:64 H指数:5 供职机构: 河南农业大学 更多>> 发文基金: 河南省科技攻关计划 河南省基础与前沿技术研究计划项目 河南省教育厅科学技术研究重点项目 更多>> 相关领域: 农业科学 医药卫生 更多>>
猪伪狂犬病毒YZ株gE全基因的克隆与序列分析 被引量:1 2015年 为了解猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因的遗传变异特性,根据Gen Bank已发表的PRV gE全基因序列,设计并合成1对特异性引物,对PRV YZ株进行了gE全基因的扩增、克隆及测序,并与其他参考毒株gE基因进行比较序列分析。测序结果表明,YZ株gE全基因序列由1862bp组成,与GenBank已发表的13株PRV gE参考株序列同源性介于97.9%-99.9%。进化树分析表明,YZ株与目前国内流行的毒株在同一进化分支内,与国外分离株有一定差异。 朱前磊 方先珍 程果 毕亚楠 乔涵 付朋飞 王淑娟 陈红英关键词:伪狂犬病毒 E基因 表达猪细小病毒VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒在小鼠体内的免疫反应 被引量:9 2016年 为了研制出能够同时预防猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的二联活疫苗,本研究将PPV VP2基因克隆到伪狂犬病毒通用转移质粒pG中,构建重组伪狂犬转移质粒pGVP2。利用脂质体转染法将重组质粒pGVP2和PRV HB98弱毒株DNA共转染至猪睾丸(ST)细胞,使其在ST细胞内发生同源重组,经5次绿色荧光空斑纯化重组病毒rPRV-VP2。分别用重组病毒rPRV-VP2、亲本PRV HB98弱毒株、商品化PPV灭活苗和DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性昆明小鼠,2周后进行二免。一免后第7周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒。结果获得表达VP2基因的重组病毒rPRV-VP2,经ELISA试验、血清中和试验(SN)、血凝抑制试验(HI)和流式细胞检测发现,重组病毒rPRV-VP2株可有效刺激小鼠机体产生抗PPV和PRV抗体,同时具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力,且对PRV强毒攻击具有保护作用。结果表明,重组病毒rPRV-VP2可作为同时预防PPV和PRV感染的重组疫苗候选株。 付朋飞 潘鑫龙 乔涵 杨兴武 朱前磊 郭晓庆 张宇 陈红英关键词:猪细小病毒 猪伪狂犬病毒 VP2蛋白 重组病毒 免疫效力 表达猪细小病毒VP2蛋白的猪伪狂犬病病毒rPRV-VP2株的生物学特性 被引量:8 2017年 探索重组PPV VP2基因的猪伪狂犬病病毒rPRV-VP2株作为弱毒疫苗候选株的潜在价值,对其在多种细胞上的增殖特性、病毒滴度、最适培养细胞中的遗传稳定性、一步生长曲线、转录和翻译水平等生物学特性进行研究,并初步探索对小鼠安全性。结果显示:重组病毒rPRV-VP2株在VERO、ST、PK-15和IPEC细胞上的TCID50分别为104.375/0.1mL、106.5/0.1mL、103.75/0.1mL、105.625/0.1mL。重组毒与亲本毒PRV HB-98株在ST细胞中的毒力(106.125 TCID50/0.1mL)和细胞病变相当,重组病毒保持了PRV病毒的通性。连续传毒20代后的绿色荧光观察、RTPCR、Western blot试验结果均表明重组病毒中的VP2基因得到了有效表达,且遗传稳定性良好。安全性试验结果显示:重组毒对小鼠安全。本试验为后期对PPV VP2基因重组猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的开发利用奠定了基础。 付朋飞 乔涵 张宇 杨兴武 徐朋丽 陈红英关键词:猪细小病毒 VP2基因 PRV 生物学特性 猪α干扰素基因在干酪乳酸杆菌中的表达 从质粒pMD18-IFN-α扩增出猪α干扰素(IFN-α)基因成熟蛋白序列,克隆到含有信号肽的质粒pUCK-SP中,获得重组质粒pUCK-SP-IFN-α。再将NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切获取的SP-IFN-α片段插入到同... 陈红英 马世杰 李坤 付朋飞 郭晓庆 高晓云 崔保安关键词:猪Α干扰素 基因表达 抗病毒活性 文献传递 猪α干扰素基因在干酪乳酸杆菌中的表达 从质粒pMD18-IFN-α扩增出猪α干扰素(IFN-α)基因成熟蛋白序列,克隆到含有信号肽的质粒pUCK-SP中,获得重组质粒pUCK-SP-IFN-α。再将NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切获取的SP-IFN-α片段插入到同... 陈红英 马世杰 李坤 付朋飞 郭晓庆 高晓云 崔保安关键词:猪Α干扰素 抗病毒活性 文献传递 猪圆环病毒2型和猪博卡病毒双重PCR检测方法的建立 引言猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)为仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要致病因子,属于圆环病毒科圆环病毒属[1,2]。2009年,Blomstr(o|¨)m等首次在... 付朋飞 乔涵 潘鑫龙 顾阳 郭晓庆 杨兴武 陈红英猪IFN-α基因在干酪乳酸杆菌中的表达及反应活性鉴定 2015年 【目的】构建能够稳定表达猪α-干扰素(IFN-α)成熟蛋白的重组干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei CECT5276),为将其作为口服疫苗来提高动物机体免疫力奠定基础。【方法】从质粒pMD18-IFN-α扩增出猪IFN-α成熟蛋白基因,再将其定向克隆到干酪乳酸杆菌整合型表达载体pMJ67的lac启动子下游,得到重组质粒pMJ67-IFN-α,电穿孔转化干酪乳酸杆菌。抽提干酪乳酸杆菌基因组DNA,进行PCR扩增及测序鉴定。采用半定量RTPCR检测猪IFN-αmRNA在干酪乳酸杆菌中的转录水平;采用Western blot对重组干酪乳酸杆菌菌体进行分析,检测其表达产物的活性;用双抗体夹心ELISA法确定最适的乳糖诱导质量浓度。【结果】PCR扩增获得了501bp的IFN-α,成功构建了重组质粒pMJ67-IFN-α,转化干酪乳酸杆菌后获得了重组乳酸杆菌。半定量RT-PCR结果显示,IFN-αmRNA在诱导16h时表达水平最高;Western blot分析表明,构建的重组干酪乳酸杆菌成功表达出了相对分子质量约19ku的重组蛋白,其可与鼠抗猪IFN-α抗体发生特异性反应。ELISA结果表明,当乳糖诱导质量浓度达到8g/L时,猪IFN-α成熟蛋白的表达量达到最大,为1.3μg/L。【结论】将猪IFN-α成熟蛋白基因整合到干酪乳酸杆菌基因组中,构建的重组乳酸杆菌能够稳定表达猪IFN-α成熟蛋白。 马世杰 李坤 付朋飞 郭晓庆 高晓云 崔保安 陈红英关键词:电力系统 表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒的免疫原性 将PCV2 ORF2基因插入到PRV通用载体pG中,利用脂质体LipofectamineTM2000试剂盒将重组转移质粒pGO与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,通过3轮蚀斑纯化重组病毒。将重组病毒、... 陈红英 崔保安 钞安军 付朋飞 郭晓庆 高晓云关键词:灭活疫苗 基因重组 猪伪狂犬病病毒 免疫效力 文献传递 重组猪细小病毒VP2基因的猪伪狂犬病毒rPRV-VP2株的构建及纯化 被引量:2 2016年 参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本实验室构建的含绿色荧光蛋白标记基因的伪狂犬病毒(PRV)通用转移质粒pG和构建好的pMD-VP2质粒,用BamHⅠ对质粒pG和pMD-VP2进行酶切,然后用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理,纯化回收后将VP2基因插入pG质粒中获得重组伪狂犬病毒转移质粒pGVP2。用脂质体转染法将PRV HB-98株全基因组与质粒pGVP2共转染ST细胞,得到携带有PPV VP2外源抗原基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2株。结合VP2基因PCR扩增和绿色荧光观察,经5轮病毒空斑纯化得到了纯化的重组病毒rPRV-VP2株。 付朋飞 乔涵 杨兴武 张宇 王林青 郭晓庆 潘鑫龙 陈红英关键词:PRV 猪细小病毒 VP2基因 表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒的免疫原性 将PCV2 ORF2基因插入到PRV通用载体pG中,利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂盒将重组转移质粒pGO与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,通过3轮蚀斑纯化重组病毒。将重组病毒... 陈红英 崔保安 钞安军 付朋飞 郭晓庆 高晓云关键词:ORF2基因 伪狂犬病病毒 重组病毒 免疫效力 文献传递