目的:构建组成型表达重组人C-反应蛋白(Recombinant human C-reactive protein,rhCRP)的毕赤酵母工程菌株,表达、纯化rhCRP并鉴定其免疫反应性。方法:将设计合成的rhCRP基因克隆到表达载体pGAPZαA上并转化至毕赤酵母X-33中进行组成型分泌表达,通过His亲和层析柱纯化rhCRP。分别采用SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA法检测目的蛋白并鉴定其免疫反应性。结果:重组表达载体pGAPZαA/rhCRP经酶切及DNA测序鉴定构建成功。重组毕赤酵母工程菌株成功组成型表达23kDa的rhCRP,27h即达到最大表达水平,表达量约3mg/L。经一步分离纯化获得纯度为96.58%的rhCRP,经间接ELISA检测表明其具有免疫反应性。结论:成功构建了组成型分泌表达rhCRP的毕赤酵母菌株,为进一步自主研发人CRP检测试剂奠定了基础。
【目的】使用自行设计的类弹性蛋白(Elastin-like protein,ELP)ELP[I]50作为非色谱纯化标签,分离纯化重组硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx),并研究聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)对ELP[I]50-Trx相变温度(Inverse temperature transition,Tt)的影响。【方法】人工合成Trx基因,将其亚克隆到自行构建的表达载体pET28编码ELP[I]50标签下游,转入大肠杆菌BLR(DE3)进行表达。融合蛋白表达后,采用可逆相变循环(Inverse transitioncycling,ITC)分离纯化,并检测不同浓度PEG时的Tt值。【结果】成功表达、分离纯化出融合蛋白ELP[I]50-Trx,检测出该蛋白浓度为25μmol/L时,Tt为28.6°C;而当PEG的浓度为5%、10%、15%、20%时,Tt分别降至22.3°C、15.9°C、6°C、0°C。【结论】ELP[I]50标签高效纯化重组蛋白具有操作简便、成本较低、易于扩大的优势,而PEG能降低蛋白的Tt值,进一步增强分离纯化效果,扩大使用范围,可望应用于分离纯化多种重组蛋白。
目的:研究聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)对类弹性蛋白(elastin-like protein,ELP)ELP[I]40相变温度(inverse temperature transition,Tt)的影响。方法:设计并合成ELP[I]40基因(由40个(VPGIG)五肽单元串联组成),表达纯化后,检测不同浓度PEG条件下ELP[I]40的Tt。结果:在ELP[I]40终浓度为25μmol/L时,PEG浓度为5%,10%,15%,20%,25%时分别使Tt由29℃降至26.5℃,22℃,15.2℃,8.8℃,2.5℃。结论:PEG可降低ELP的Tt,可通过PEG促进ELP重组蛋白分离纯化。
