肖红剑
- 作品数：30 被引量：37H指数：3
- 供职机构：中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所更多>>
- 发文基金：云南省自然科学基金协和青年科研基金云南省重点新产品开发计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程理学更多>>
- 一种DNA病毒基因组的定点改造方法
- 本发明提供了一种DNA病毒基因组的定点改造方法，解决了现有技术诱导DNA病毒基因组定点突变困难，插入外源片段操作复杂，重组率较低的问题。将携带有核酸酶系统的质粒转染细胞后，再感染病毒，待细胞出现病变后，收集病变细胞，经冻...
- 寸韡李琦涵毕研伟孙乐高丹丹丁晨李智华肖红剑闫玲梅
- 文献传递
- 重组B群脑膜炎球菌fHBP融合蛋白的表达和免疫原性研究被引量：2
- 2011年
- 采用PCR构建编码B群脑膜炎球菌fHBP蛋白V1变异型全长序列和V2变异型C结构域抗原表位融合蛋白的基因片段。并克隆入pET30a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在其实现表达,表达量约占菌体蛋白总量的30%。表达产物经离子交换层析纯化后,获得了纯度达到90%以上的融合蛋白。将融合蛋白免疫小鼠,对其免疫原性进行了初步分析。结果显示,经2次腹腔免疫,血清IgG滴度达到15 849,同时杀菌力实验显示此融合蛋白能诱导针对B群脑膜炎球菌的补体依赖的杀菌反应。表明此融合蛋白具有较好的免疫原性,为B群脑膜炎球菌蛋白疫苗的研究提供了一定的理论基础。
- 彭世泽肖红剑彭正华毕妍伟孙振璐戴宗祥高丹丹徐维明李智华李健峰
- 关键词：脑膜炎奈瑟氏菌原核表达融合蛋白
- 分光光度法标定酵母超滤液浓度及其在脑膜炎球菌培养基优化过程中的应用
- 2017年
- 目的:建立检测酵母超滤液浓度的方法,并探索适合A、C群脑膜炎球菌生长的无动物源性培养基中酵母超滤液的浓度。方法:通过全波长扫描及不同波长吸光度值的比较确定检测酵母提取物浓度的最佳波长;用3000 Da超滤膜超滤酵母提取物溶液,制备酵母超滤液并检测其性质;观察脑膜炎球菌在含不同批次酵母超滤液的半综合培养基中的生长情况,验证不同批次标化的酵母超滤液的稳定性;配制含不同浓度酵母超滤液的半综合液体培养基,观察A、C群脑膜炎球菌的生长情况。结果:通过全波长扫描及不同波长吸光度值的比较,确定了检测酵母提取物浓度的最佳波长为405 nm;采用3000 Da超滤膜超滤后的酵母超滤液不与CTAB产生沉淀,通过检测其D_(405nm)值,可以确定酵母超滤液的浓度;从生长情况考虑,A、C群脑膜炎球菌半综合培养基中最优酵母超滤液浓度分别为4、2 mg/L。结论:建立了制备酵母超滤液及分光光度法标定酵母超滤液浓度的方法,确定了培养A、C群脑膜炎球菌半综合培养基中最优酵母超滤液浓度。
- 毕研伟肖红剑丁晨闫玲梅寸韡
- 关键词：酵母提取物分光光度法脑膜炎球菌
- 重组肠激酶催化亚基在毕氏酵母中的高密度发酵、纯化及活性鉴定被引量：2
- 2012年
- 应用RT-PCR和搭桥PCR技术,扩增肠激酶催化亚基的cDNA,测序正确后克隆至酵母分泌型表达质粒p9K中.将重组质粒p9K/EKLC转化至表达宿主pichia pastoris GS115,筛选得到高效表达重组牛肠激酶催化亚基工程菌.经甲醇诱导,目标蛋白肠激酶催化亚基(EKLC)表达并分泌至酵母培养基中.高密度发酵后,经超滤浓缩,采用SP Sepharose F.F一步纯化得到纯度达98%以上的重组目的蛋白,活性达到2.3 U/uL.上述结果表明,本实验成功获得了肠激酶催化亚基,它是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.
- 姬秋彦毕研伟肖红剑闫玲梅高丹丹李智华
- 关键词：分泌表达高密度发酵
- B群脑膜炎球菌lpxL2基因敲除突变株的构建及初步鉴定
- 2011年
- 应用基因敲除技术的方法和原理,通过PCR扩增B群脑膜炎球菌lpxL2基因及载体pGBK T7上的Kan抗性片段,lpxL2片段与puc-18载体连接得到重组质粒msb-puc,以重组质粒msb-puc为基础,分别通过反向PCR和酶切2种方法构建lpxL2基因中间片段的缺失,并在缺失位点连入Kan抗性表达盒,从而得到重组质粒mpK,mpK转化B群脑膜炎球菌,并用PCR的方法对转化子进行初步筛选鉴定,初步确定突变株1株.本研究通过基因敲除MenB中LPS合成途径相关基因lpxL2的方法,降低LPS毒性,为B群脑膜炎球菌OMV疫苗的研发做了铺垫.
- 李晓晶姬秋彦肖红剑彭正华罗娜杨增福杨槐李健峰李智华徐维明
- 关键词：脑膜炎奈瑟氏菌基因敲除脂多糖
- 树鼩γ干扰素在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性鉴定被引量：2
- 2018年
- 目的:克隆树鼩γ干扰素(IFNγ)基因,在大肠杆菌中高效表达纯化并鉴定其免疫原性。方法:提取树鼩肺组织总RNA,经RT-PCR扩增出树鼩IFNγ基因,再克隆到原核表达载体p ET30a(+),构建重组表达质粒p ET-30a(+)-IFNγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩IFNγ;经金属螯合柱复性及纯化,Western印迹和ELISA检测其免疫原性,并检测不同组织中IFNγ的分布情况。结果:构建了重组表达质粒p ET-30a(+)-IFNγ,重组蛋白在30℃、1 mmol/L IPTG诱导4 h获得较高表达量,镍柱复性纯化后得到较高纯度的树鼩IFNγ。Western印迹显示IFNγ可与兔抗人IFNγ单克隆抗体特异性结合,应用Western印迹和ELISA分别检测树鼩IFNγ的免疫原性和抗体滴度,在树鼩的鼻、心、肝、肺、肾、气管中检测到IFNγ。结论:在大肠杆菌中高效表达了重组树鼩IFNγ,复性纯化后具有良好的免疫原性。
- 丁晨肖红剑龙琼李智华毕研伟闫玲梅李育中姚月婷寸韡
- 关键词：树鼩Γ干扰素原核表达免疫原性
- 树鼩干细胞生长因子的原核表达、纯化及免疫原性被引量：1
- 2019年
- 目的原核表达、纯化树鼩干细胞生长因子(stem cell factor,SCF),并检测其免疫原性。方法根据GenBank预测的树鼩SCF基因序列设计引物,PCR扩增SCF基因,克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-SCF,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Ni柱纯化后,免疫家兔,Western blot和ELISA法检测其免疫原性,并检测SCF在树鼩不同组织中的分布情况。结果重组表达质粒pET-30a(+)-SCF经酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为34 500,表达量约占菌体总蛋白的35. 6%,以包涵体形式存在;纯化后的重组蛋白纯度达90%以上,可与兔抗人SCF多克隆抗体特异性结合,且免疫原性良好,抗血清效价为1∶256 000。在鼻、气管、肺、脾、肾、食管中能检测到SCF的分布。结论在大肠埃希菌中高效表达了重组SCF蛋白,纯化复性后具有良好的免疫原性。
- 龙琼郝嘉茂徐盟毕研伟肖红剑李智华闫玲梅丁晨李育中姚月婷寸韡
- 关键词：树鼩干细胞生长因子原核表达纯化免疫原性
- 重组人甲状旁腺激素肽(1-34)在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化被引量：3
- 2006年
- 人工合成人甲状旁腺激素1～34肽段(PTH134)的cDNA序列,克隆到大肠杆菌蛋白表达载体pThioHis中,获得了高表达菌株。经发酵、破菌、金属螯合层析、反相层析和凝胶层析后获得了纯度大于95%的hPTH134,hPTH134肽N端测序和质谱分子量测定结果与天然PTH134一致。生物学活性研究表明,hPTH134在体外具有刺激腺苷酸环化酶的作用。
- 李健峰肖红剑姬秋彦李智华龙海亭阎玲梅罗娜徐维明
- 关键词：人甲状旁腺激素大肠杆菌
- 一种用于检测甲型肝炎病毒滴度的细胞系及其构建方法与应用
- 本发明涉及一种用于检测甲型肝炎病毒滴度的细胞系及其构建方法与应用。本发明利用3ABC蛋白酶能与MAVS相互的性质，将MAVS C端与荧光蛋白构建融合蛋白，并将其包装成慢病毒颗粒，感染细胞后，表达的融合蛋白会锚定在细胞质中...
- 寸韡毕研伟龙琼肖红剑李育中
- 不同信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌H因子结合蛋白表达的影响被引量：2
- 2017年
- 目的探讨不同信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌H因子结合蛋白(factor H-binding protein,f HBP)表达的影响。方法运用PCR方法将B群脑膜炎奈瑟菌f HBP原始信号肽分别替换为大肠埃希菌主要外膜脂蛋白(major outer membrane lipoprotein,MLP)、脂蛋白-28(lipoprotein-28,LP)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)P4外膜蛋白信号肽,并将其分别连接至p ET-30a表达载体,转化入大肠埃希菌感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达水平。结果替换了P4、LP和MLP信号肽的重组B群脑膜炎奈瑟菌f HBP表达量较带原始信号肽的B群脑膜炎奈瑟菌f HBP相比,分别提高了2.68、1.94和2.91倍。结论替换MLP信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌f HBP蛋白表达的影响最大,为提高B群脑膜炎奈瑟菌f HBP表达量的研究工作提供了新思路。
- 宫悦陈晨李亚东张辉李智华肖红剑毕研伟寸韡
- 关键词：信号肽原核表达
