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重组乙酰胆碱酯酶的表达及其分子进化研究进展被引量：3: 2012年; 乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是酶抑制法检测农药残留的核心试剂。但天然提取的AChE存在含量低、纯化困难、稳定性差等不足,因此,高性能的重组AChE制备成为研究学者关注的热点。文中综述了重组AChE的表达、和分子进化等方面的研究成果,并指出酶定向进化策略与表面展示技术结合是重组AChE活性改造的未来趋势。; 董洁娴李振峰雷红涛何永盛王弘孙远明; 关键词：农药残留

抗孔雀石绿单链抗体-碱性磷酸酶融合表达和活性鉴定被引量：3: 2016年; 采用重叠延伸的方法成功将抗孔雀石绿(malachite green,MG)单克隆细胞的轻链VL和重链VH用连接肽(Gly_4Ser)_3连接,形成单链抗体(single chain variable fragment,scFv)基因,并将其酶切连接进入含有碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,PhoA)基因的载体plip6/GN中,成功构建重组质粒plip6/GN-MG-scFv。随后重组质粒转入大肠杆菌BL21,经诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting鉴定结果表明所获得的融合蛋白sc Fv-PhoA大小约72 kD。利用scFv与MG特异性结合的活性和PhoA催化对硝基苯磷酸二钠的显色机制,经过直接竞争酶联免疫吸附法测定融合蛋白scFv-PhoA的IC_(50)为9.81 ng/mL。本方法操作简单、灵敏度高且检测时间短,这为进一步进行MG免疫法快速检测提供了参考。; 伍伟健董洁娴饶美芳詹屋强王弘孙远明; 关键词：孔雀石绿单链抗体碱性磷酸酶

一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法: 本发明公开了一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法。本发明的制备方法，步骤为：以杂交瘤细胞总mRNA为模板反转录得cDNA，选用简并性低的通用引物扩增全套抗体重链可变区和轻链可变区基因；将扩增出的重、轻链可变区基因序列输...; 孙远明董洁娴王弘雷红涛李振峰徐振林杨金易沈玉栋; 文献传递

基于定点突变的抗克百威单链抗体的亲和力成熟被引量：4: 2012年; 为获得亲和力更高的抗克百威(CBF)单链抗体(scFv),从抗CBF scFv氨基酸序列出发,通过同源模建获得抗体模型,找出抗体中的活性口袋区域,进而将小分子药物与抗体进行分子对接,发现疏水作用和氢键对于抗体亲和力具有重要作用.进一步对口袋内亲水氨基酸残基HArg40和LHis38进行模拟替换,再进行分子对接分析,发现当以亮氨酸为突变氨基酸时,对接评分最高.在此基础上,通过构建突变scFv基因及可溶性表达,采用ELISA法对进化后的单链抗体(evoscFv)进行了鉴定.结果表明,evoscFv对CBF的IC50值为18.11μg/L,低于野生型抗体的27.25μg/L,亲和解离常数Kd为4.06×10-8mol/L,相对亲和力比野生型scFv提高了2.23倍,说明通过分子对接分析及对抗体活性口袋中氨基酸残基进行替换,获得了一个亲和力更高的突变体抗体.; 邓龙肖治理董洁娴王弘杨武英谢曦杨金易沈玉栋孙远明; 关键词：克百威单链抗体分子对接定点突变

薇菜异黄酮的微波辅助提取及其抑菌性研究被引量：7: 2014年; 薇菜异黄酮的微波辅助提取及其抑菌性进行了研究,以乙醇为溶剂,考查时间、温度、乙醇体积分数、微波功率对提取效率的影响,用L9(34)正交试验,确定了从薇菜中提取异黄酮的最佳工艺条件为:乙醇体积分数为80%,时间5 min,温度50℃,微波功率为400 W。此条件下提取率为0.378 3%。并对薇菜异黄酮做了抗菌谱的测定,结果表明薇菜异黄酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC为6.25%,对根霉的MIC为12.5%,对枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的MIC为25%。; 杨辑董洁娴赵晟楠; 关键词：薇菜异黄酮抑菌性

家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace在毕赤酵母GS115中的表达及其分析被引量：2: 2012年; 【目的】构建表达家蚕乙酰胆碱酯酶(BmAChE)的毕赤酵母菌株,实现BmAChE在毕赤酵母中分泌表达并对其活性进行分析。【方法】从家蚕头部提取总RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,通过PCR扩增出家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace并进行序列测定。采用PCR及重叠延伸PCR去除原bmace中的信号肽和疏水肽,并对序列中存在的2个A+T富含区进行同义密码子替换的改造。将改造后的bmace与表达载体pPIC9K连接,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,以Ellman法测定酶活力,毒扁豆碱和有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制试验分析重组BmAChE(rBmAChE)的生物活性。【结果】改造后的bmace经重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为70 kD的蛋白,具有AChE活性,酶比活力约为1 187 U.mg-1。抑制试验显示,该rBmAChE能够被毒扁豆碱强烈抑制,并且可被皮蝇磷等10种有机磷农药和克百威等5种氨基甲酸酯类农药抑制,最低抑制浓度IC50值可达2.78×10-10mol.L-1。【结论】成功构建分泌表达BmAChE的毕赤酵母菌株,其表达了具有良好活性的rBmAChE,可用于进一步制备有机磷及氨基甲酸酯类农药快速检测分析制剂。; 何永盛陈舒迟王弘韩双艳杨琼刘细霞董洁娴杨武英孙远明; 关键词：毕赤酵母活性分析氨基甲酸酯类农药

抗克伦特罗核糖体展示单链抗体文库的构建及鉴定被引量：2: 2011年; 构建大容量核糖体展示抗克伦特罗单链抗体(single-chain fragment variant,scFv)文库,为进一步筛选抗体奠定基础。用克伦特罗人工抗原免疫小鼠,分离其脾细胞;Trizol法抽提总RNA,反转录成cDNA,PCR及重叠延伸PCR法构建核糖体展示scFv文库。再通过PCR和重叠延伸PCR在scFv文库序列5'端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点,3'端添加间隔区序列(T20-V109)、茎环结构构建核糖体展示抗克伦特罗scFv文库。核糖体展示scFv文库与Easy T3载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选,挑取5个阳性克隆双酶切和测序鉴定。结果表明:用于建库材料的免疫小鼠效价为1:128000;成功扩增重链可变区基因大约为360bp和轻链可变区基因大约为330pb;核糖体展示scFv文库基因大约1200bp;库容量达1.75×1013;阳性重组质粒均含有1200bp插入片段;利用IMGT/V-QUEST数据库对单链抗体可变区进行序列分析结果表明,重链可变区和轻链可变区基因均由胚系基因重排得到,且与鼠源胚系基因同源率都达84%以上;氨基酸序列比对结果表明,重链可变区氨基酸序列同源率为37.82%,轻链可变区氨基酸序列同源率为39.09%。其中多样性主要发生在VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。成功构建了大容量抗克伦特罗单链抗体核糖体展示文库。; 刘细霞孙远明董洁娴杨武英谢曦王弘; 关键词：核糖体展示克伦特罗

虾肉中呋喃它酮代谢物化学发光酶免疫分析方法的建立被引量：12: 2012年; 采用对碘苯酚增强的HRP-鲁米诺-H2O2化学发光体系,建立了虾肉中呋喃它酮代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)残留的间接竞争化学发光酶免疫分析(icCLEIA)检测方法。检测所用抗体是基因重组的抗AMOZ衍生物单链抗体。优化的icCLEIA最佳工作条件为:AMOZA-OVA包被浓度62.5μg/L,抗AMOZ衍生物单链抗体最佳稀释度为1∶10,竞争免疫反应时间45 min,HRP酶标记羊抗鼠抗体最佳稀释度为1∶10000,孵育时间50 min。本方法的IC50为1.38μg/L;灵敏度为0.09μg/L;线性范围为0.26～9.08μg/L(IC20～IC80);批内和批间相对标准偏差均小于15%;抗AMOZ衍生物单链抗体与其它硝基呋喃类抗生素及其代谢物均没有交叉反应,特异性良好。4个不同添加量的AMOZ加标样品的平均回收率分别为72.2%,73.4%,72.6%和78.6%。与HPLC-MS/MS法测定值进行比较发现,两种方法相关性良好(R2=0.9997)。本方法可用于水产品中AMOZ残留的快速检测。; 杨武英董洁娴沈玉栋杨金易王弘徐振林杨星星孙远明; 关键词：刀额新对虾辣根过氧化物酶

一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法: 本发明公开了一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法。本发明的制备方法，步骤为：以杂交瘤细胞总mRNA为模板反转录得cDNA，选用简并性低的通用引物扩增全套抗体重链可变区和轻链可变区基因；将扩增出的重、轻链可变区基因序列输...; 孙远明董洁娴王弘雷红涛李振峰徐振林杨金易沈玉栋; 文献传递

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