谢灿
- 作品数：9 被引量：28H指数：3
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人呼吸道合胞病毒M蛋白非复制型重组腺病毒的构建和鉴定被引量：2
- 2008年
- 人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)基质蛋白(matrix protein,M)在RSV形态发生上具有重要作用,因含有CTL及CD4+T细胞抗原表位,在疫苗研究上具有一定意义。为此,应用RT-PCR方法从感染RSV的HEp-2细胞中扩增获得M蛋白基因,构建了含M基因的非复制型重组腺病毒并进行表达和鉴定。基因序列分析显示RSV M基因仅有一处碱基发生错义突变。获得的非复制型重组腺病毒FGAd/RSVM感染293细胞,观察到细胞出现CPE,RT-PCR发现M基因有转录,Western blotting及间接免疫荧光分析检测到M蛋白。成功克隆A亚型RSV Long株M基因,并获得一株可表达A亚型RSV M蛋白的非复制型重组腺病毒FGAd/RSVM,可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用。
- 尚智何金生张梅虞结梅陆燕燕谢灿唐倩魏薇
- 关键词：人呼吸道合胞病毒M蛋白
- T7 RNA聚合酶的克隆及其介导基因转录功能的鉴定被引量：7
- 2007年
- 目的构建含T7RNA聚合酶(T7RNA Polymerase,T7RNP)的真核表达载体,同时构建含T7启动子、增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)和T7RNP转录终止信号的载体,并通过观察EGFP的表达推测T7RNP表达和T7表达系统介导基因转录的功能。方法根据编码T7RNP的基因序列,应用PCR技术从含有T7RNP基因的E.coli BL21(DE3)基因组中扩增编码T7RNP的基因片段,克隆至载体pcDNA3·1(+)。同时从px8δt载体和pGEM-Teasy/EGFP上切下T7RNP识别的终止信号(terminator,TER)和编码EGFP的基因,克隆至载体pcD-NAII。将获得的两个重组质粒共转染BHK细胞。48h后,通过观察EGFP基因在真核细胞内的表达情况,推测T7RNP基因的表达及表达后识别T7启动子介导基因转录功能。结果成功构建了含T7RNP编码基因的真核表达载体pcDNA3·1(+)/T7RNP和原核表达载体pcDNAII/EG-FP/TER,共转染BHK细胞后,可观察到EGFP表达的绿色荧光。结论T7RNP能顺利在真核细胞内表达,并通过与T7启动子和TER的相互作用,成功实现了EGFP基因的转录和表达。
- 虞结梅杨兵谢灿陆燕燕何金生
- 辅助病毒依赖型腺病毒载体转基因的体外表达效率被引量：1
- 2010年
- 构建可表达增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(Helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和体外表达鉴定。荧光显微镜证实HDAd/EGFP可表达,电镜下观察到经CsCl纯化后的腺病毒的典型形态。分光光度计法测定病毒的浓度为4.0×1012颗粒数(Virus particle,vp)/mL。与可表达EGFP的第一代腺病毒载体(First generation adenoviral vector,FGAd)FGAd/EGFP进行了体外感染和转基因表达效率的比较研究,分别用约2000vp/细胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549细胞,流式细胞仪检测EGFP的表达情况。通过相同时间点流式细胞仪分析EGFP的表达情况,可见HDAd/EGFP感染早期的A549细胞较FGAd/EGFP有更高的荧光表达率及更高的表达强度,显示HDAd载体具有转基因瞬时高表达的特性,是一种更有价值的疫苗载体。
- 郑娴娴何金生付远辉徐少华谢灿石长信张梅王小波洪涛
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白转基因表达
- 大鼠脂肪干细胞体外定向诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的研究被引量：5
- 2007年
- 目的研究大鼠脂肪干细胞的基本生物学特性及其向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化潜能。方法取6周龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,胶原酶消化法分离出脂肪干细胞,体外培养。取第3代细胞,免疫细胞化学测定其CD44、CD34抗原表达,分别用成脂和成骨诱导培养液诱导其向脂肪细胞及成骨细胞分化。油红染色、碱性磷酸酶染色和vonKossa染色鉴定其分化能力。结果大鼠脂肪干细胞生长能力旺盛,表达CD44,而不表达CD34;定向诱导后,油红染色、碱性磷酸酶染色和vonKossa染色阳性。结论大鼠脂肪组织可分离培养出脂肪干细胞,能向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化,有可能成为组织工程理想的种子细胞来源之一。
- 程文丹赵宇何金生汪春兰王帮河谢灿张梅陆艳艳
- 关键词：成骨细胞脂细胞
- 减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的人呼吸道合胞病毒DNA疫苗免疫保护作用研究
- 目的:人呼吸道合胞病毒/(Human Respiratory Syncytial Virus,RSV/)广泛分布于世界各地,是导致婴幼儿严重下呼吸道感染的最重要的病毒病原。目前尚无特异性防治方法,世界卫生组织将发展RSV...
- 谢灿
- 关键词：人呼吸道合胞病毒F蛋白真核表达质粒
- 文献传递
- 可经粘膜途径递送DNA疫苗的减毒伤寒沙门菌载体的研究进展
- 2008年
- DNA疫苗的本质是在哺乳动物细胞内表达重组蛋白抗原的质粒DNA，DNA疫苗能刺激机体产生体液及细胞免疫，有效的DNA疫苗载体可向细胞内高效传送质粒DNA。伤寒沙门菌是细胞内寄生菌，可通过黏膜途径感染，穿过黏膜上皮细胞屏障侵入黏膜相关淋巴组织（MALT），被MALT内专职抗原递呈细胞（APC）吞噬，并可在细胞吞噬泡内存活和增殖，同时细菌本身的病原相关分子模式（PAMP）是天然佐剂，因此可诱导机体产生有效的系统和局部经黏膜免疫应答，是极有发展潜力的经黏膜途径递送DNA疫苗的载体。
- 谢灿何金生
- 关键词：DNA疫苗疫苗载体
- HDAd/F载体及制备方法和用途
- 一种表达RSV F蛋白的HDAd/F载体，由HDAd载体质粒和含有编码RSV F蛋白基因的HDAd穿梭质粒构建、辅助病毒辅助得到的载体，包括左、右侧末端倒置重复序列ITRs，包装信号ψ，在I－Sce I和I－Ceu I之...
- 何金生石长信洪涛杨兵谢灿付远辉张梅彭向雷
- 文献传递
- 真核表达人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法被引量：3
- 2008年
- 目的真核表达人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F),并完成蛋白纯化及纯度测定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物,PCR方法扩增出3′端带His标签的F基因序列,克隆入pGEM-T-easy载体,经核酸序列分析后,进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体,限制性内切酶鉴定,用脂质体Lipofectamine 2000转染COS-7细胞,72h后再用Western blot检测目的蛋白的表达。Ni柱亲和层析纯化COS-7细胞表达的F蛋白,高效毛细管电泳分析纯化后蛋白纯度。结果核酸序列分析证实获得带His标签的RSVF基因序列,没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,利用Western blot方法检测到F蛋白的特异性条带,纯度达99%以上。结论初步建立了真核表达RSVF蛋白的纯化方法,为进一步优化RSVF蛋白制备条件及单克隆抗体及诊断试剂等研究奠定了基础。
- 陆燕燕何金生张梅虞结梅谢灿袁媛薛绍礼宋蔚郑娴娴
- 关键词：人呼吸道合胞病毒F基因真核表达纯化
- 可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备被引量：11
- 2007年
- 构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV启动子序列的F基因亚克隆至克隆载体pSC11,鉴定正确后,克隆至HDAd质粒pSC15B,构建pSC15B/F HDAd重组质粒,PmeⅠ消化pSC15B/F去除原核复制元件及抗性基因,获得HDAd/F DNA分子,经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞,16h后感染辅助病毒,收获HDAd/F载体粗提液,随后以HDAd/F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/F达到复制极限,同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。与辅助病毒共感染293Cre4细胞进一步扩增HDAd/F、CsCl梯度法超速离心制备大量纯化的HDAd/F载体,体外感染293细胞,RT-PCR检测到F基因有转录,Western blot分析表明F蛋白有特异性表达。总之,成功构建HDAd/F载体并在真核细胞中实现表达,为体内免疫学效力试验奠定基础,为研制RSV疫苗提供了一种新方法。
- 杨兵何金生石长信张梅虞结梅谢灿陆燕燕付远辉彭向雷洪涛
- 关键词：逆转录聚合酶链式反应免疫印迹
