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Sparc基因的克隆及其在HEK293细胞中的表达: 2013年; 目的:为探讨SPARC(secreted protein acidic and rich in cysteine)在人恶性肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制,进一步明确SPARC发挥作用的方式及其与肿瘤发生类型的关系。方法:我们首先提取了人乳腺癌细胞系MCF-7的总RNA,在对总RNA进行纯度与定量检测后,利用RT-PCR的方法,以该总RNA为模板,将其反转录为cDNA;再设计引物,以该cDNA为模板,利用PCR扩增出包含Sparc编码区的DNA片段,将该产物纯化后通过T-A克隆连接入pMD20-T载体,利用菌落PCR及DNA测序进行鉴定。以pMD20-T-Sparc为模板,我们设计了特异的针对Sparc全长编码区的引物,并在引物5'端分别加入BamHI、HindIII酶切位点,通过PCR将Sparc编码区扩增出来,经纯化及双酶切后与真核表达载体pcDNA3.1myc-his(-)相连,再经菌落PCR和DNA测序进行鉴定。通过瞬时转染的方法,利用脂质体将所构建的重组SPARC真核表达载体转染HEK293细胞,48h后裂解所培养的细胞,使用western blot检测有无SPARC的表达。结果:测序证实所克隆的Sparc编码区cDNA正确地插入pcDNA3.1myc-his(-)中,western blot检测证实其在HEK293细胞中得到表达,而空载体转染的细胞则无表达,说明所构建的pcDNA3.1myc-his(-)-Sparc能够成功表达。结论:我们成功克隆了人Sparc cDNA,构建了其真核表达载体,并在HEK293细胞中得到有效表达,从而为进一步研究人SPARC的功能及其与肿瘤的关系奠定了基础。; 卜歆赵虎张淑雅王涛苏金; 关键词：SPARC 真核表达克隆 CDNA

促炎分子盘状结构域受体2在泛素化修饰过程中与泛素分子的偶联方式: 2015年; 目的研究泛素分子中哪些位点的赖氨酸(Lys)残基参与了具有促炎效应的膜受体盘状结构域受体2(DDR2)的多聚泛素化修饰。方法将DDR2、Cbl-b及泛素分子不同位点Lys的突变体共转染HEK293T细胞,以胶原蛋白刺激细胞诱导DDR2发生活化。利用免疫沉淀方法分离细胞中的DDR2,Western blot法检测DDR2与不同泛素分子的偶联情况。结果仅保留27位Lys的泛素分子偶联到DDR2分子上的能力与野生型泛素分子相接近,保留33位Lys的泛素分子有较微弱与DDR2偶联的能力。27位Lys突变可使泛素分子彻底丧失与DDR2相偶联的能力,而33位Lys突变使得泛素分子偶联DDR2的能力部分丧失。结论 Cbl-b介导的DDR2的多泛素化修饰主要是通过泛素分子的Lys27偶联的,Lys33可能也部分参与了DDR2的泛素化修饰。; 于江天卜歆赵虎李霞苏金; 关键词：盘状结构域受体2 泛素化泛素泛素连接酶 CBL-B

SPARC通过竞争性结合胶原蛋白抑制DDR2的活化: 2013年; 目的探讨富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)是否与盘状结构域受体2(DDR2)竞争性结合胶原蛋白,并观察SPARC对DDR2磷酸化水平的影响。方法采用转染小干扰RNA的方法下调人前列腺癌细胞PC-3中DDR2的表达,观察对该细胞中SPARC mRNA表达水平的影响。在HEK293T细胞中同时过表达SPARC和DDR2,在有无胶原蛋白刺激的情况下,通过免疫沉淀及Western blot法检测DDR2磷酸化水平的变化。结果下调DDR2会引起SPARC mRNA和蛋白表达水平显著下降;而SPARC能够抑制胶原蛋白刺激的DDR2磷酸化。结论 SPARC很可能通过竞争性结合胶原蛋白来抑制DDR2的活化。; 卜歆于江天张淑雅赵虎苏金; 关键词：DDR2 SPARC 胶原蛋白细胞外基质

DDR2基因缺失小鼠的繁育及子代基因型的鉴定被引量：1: 2013年; 目的:探讨盘状结构域受体2(DDR2)基因缺失小鼠的优化繁殖方法与子代小鼠DDR2基因型的鉴定方法,建立DDR2基因缺失小鼠模型,为进一步研究DDR2分子在肿瘤、肺纤维化、类风湿性关节炎等复杂疾病中的功能以及作用机制奠定基础。方法:将从美国JAX实验室引进的三对杂合子小鼠进行饲养并交配繁殖,繁殖成功后其子代中将会出现野生型、杂合子以及纯合子3种基因型。用基因组提取试剂盒试剂盒提取子鼠鼠尾的基因组DNA,经紫外分光光度计定量后,采用Taqman qPCR的方法准确鉴定出小鼠的基因型,同时观察子代小鼠各基因型的比例,并通过小鼠体态观察,进一步证实Taqman qPCR鉴定方法的可靠性。结果:DDR2基因杂合子小鼠互交繁殖可得到DDR2野生型小鼠、DDR2纯合子小鼠以及DDR2杂合子小鼠三种基因型小鼠,所得子代基本符合孟德尔遗传规律,且雌性和雄性DDR2纯合子小鼠体长均较DDR2野生型小鼠和DDR2杂合子小鼠小,鼻子也较其它基因型小鼠明显变短,无繁殖能力。依据Taqman qPCR的结果所得出的纯合子小鼠体貌特征与文献报道一致,证实了Taqman qPCR结果的可靠性。结论:雌、雄性DDR2杂合子小鼠交配可有效获得DDR2基因缺失小鼠;实验所用Taqman qPCR方法能够准确鉴定子代小鼠的基因型,DDR2纯合子小鼠的获得为后续实验的提供了较理想的动物模型。; 赵虎卜歆张淑雅任婷婷苏金; 关键词：DDR2 基因缺失基因型鉴定

人BRCA1干涉慢病毒载体的构建与验证: 2012年; 目的:设计合成干涉BRCA1表达的小干扰RNA,并克隆入pLKO.1慢病毒表达载体,为研究基因BRCA1在乳腺癌细胞增殖中的作用提供基础。方法:根据人BRCA1的基因序列,设计合成三对BRCA1干涉片段(序列前后加入酶切位点EcoRI和AgeI),再利用酶切连接反应将其插入到慢病毒载体pLKO.1中,经过酶切鉴定及测序正确后,将重组质粒转染入MCF-7细胞,48h后提取蛋白质和RNA,通过蛋白印迹验证BRCA1的蛋白水平的表达情况,Realtime PCR验证BRCA1的RNA水平的表达变化。结果:重组质粒经酶切鉴定和测序比对完全正确,转染乳腺癌细胞48h后可见BRCA1表达的明显下调。结论:成功构建BRCA1干涉的慢病毒载体,并且转染MCF-7细胞证实其能够下调BRCA1的表达,为后续研究BRCA1在乳腺癌细胞的功能奠定了基础。; 张永平赵虎韦伊芳张健药立波; 关键词：BRCA1 慢病毒载体重组质粒

E3泛素连接酶Cbl-b对白细胞介素1诱导细胞效应的负调控作用: 2015年; 本研究旨在探讨E3泛素连接酶Cbl-b对滑膜细胞中白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)信号通路的影响。采用Western blot方法检测Cbl-b基因缺失小鼠滑膜细胞中Cbl-b及IL-1诱导的基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)的表达水平。胶原底物与滑膜细胞培养上清进行共孵育后通过SDS-PAGE分析胶原的降解情况。结果显示,与野生型相比,Cbl-b基因敲除的小鼠滑膜细胞在IL-1刺激条件下表达更多的MMP-13,且培养上清具有更强的降解胶原的能力。这些结果提示,Cbl-b对IL-1诱导的细胞效应具有负调控作用。; 于江天卜歆赵虎苏金; 关键词：CBL-B 泛素连接酶白细胞介素1 基质金属蛋白酶13 滑膜细胞

DDR2基因缺失对小鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响被引量：1: 2014年; 目的:骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是骨再生工程中重要的种子细胞,它对骨组织缺损的修复有着良好的效果。但是BMSCs向成骨细胞分化并修复骨组织缺损是是由细胞外因子共同作用产生的结果。DDR2(Discoidin Domain Receptor 2)作为I型胶原的特异性受体在成骨细胞的分化中发挥重要的调节作用。而对于其在BMSCs向成骨细胞的分化过程中的所起到的作用还鲜有研究,对其作用机理尚不明确。因此我们希望通过分离、培养并鉴定比较DDR2基因缺失小鼠与野生型小鼠来源的骨髓间充质干细胞了解其生物学特性,为后续的实验奠定理论基础。方法:采用改良型的全骨髓贴壁细胞分离方法分离培养两种小鼠来源的骨髓间充质干细胞,采用流式细胞技术鉴定其表面标记物的表达,并利用诱导培养液诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成脂肪细胞分化。结果:分离培养的两种骨髓间充质干细胞形态一致,增殖能力和自我更新能力强,流式细胞术检测其表面标记物CD29,Sca-1均表达阳性,CD105,CD45表达为阴性,分离得到的两种细胞均有向成骨细胞和成脂肪细胞分化的能力,但可以明显观察到DDR2基因缺失小鼠的骨髓间充质干细胞的成骨分化能力减弱。结论:本实验通过对于DDR2基因缺失小鼠BMSCs分离、培养和鉴定,初步探索DDR2基因缺失在在成骨过程中的作用结果,为进一步研究提高BMSCs的成骨分化能力奠定理论基础。经实验证明,DDR2基因缺失小鼠来源的骨髓间充质干细胞虽然仍具备干细胞的生物学特性,但其向成骨细胞的分化能力明显减弱,说明DDR2基因缺失对其骨髓间充质干细胞的成骨分化等有着重要的影响。; 隋珂丁寅卜歆赵虎季海宁苏金; 关键词：DDR2 骨髓间充质干细胞分化

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赵虎

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