韩琪
- 作品数：11 被引量：19H指数：3
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- 转基因番茄防龋疫苗中外源目的基因拷贝数的检测被引量：7
- 2013年
- 目的:采用SYBR Green实时荧光定量PCR方法检测转基因番茄防龋疫苗中外源目的基因的拷贝数。方法:用本课题组前期构建的重组质粒pEAC10、pEPC10作为标准品,SYBR Green实时荧光定量PCR法对含外源目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的转基因番茄植株总基因组样本重复检测,取平均值作为目的基因拷贝数。结果:含pacA-ctxB转基因番茄植株外源目的基因的拷贝数为1.3,含pacP-ctxB转基因番茄植株外源目的基因的拷贝数为3.2。结论:构建的转基因番茄植株属低拷贝转基因植物,具有较好的稳定性。
- 白国辉刘建国田源陈筑白朋元韩琪顾瑜管晓燕王海慧
- 关键词：转基因番茄SYBR拷贝数CT值
- 转基因番茄中外源目的蛋白提取液的筛选被引量：1
- 2013年
- 目的比较两种不同配方的蛋白提取液提取转基因番茄蛋白的效果。方法用A、B两种植物蛋白提取液提取相同防龋用转基因番茄蛋白,运用western blot、BCA法和间接ELISA法对提取出的转基因番茄外源目的蛋白进行检测。结果两种提取液提取的蛋白样品均在相对分子质量约为60 KDa处出现了低分子量蛋白条带,但植物蛋白提取液B所提取蛋白样品条带更清晰。蛋白提取液A、B分别提取的相同转基因番茄总蛋白为8.375mg/mL和12.838 mg/mL,而其外源目的蛋白的含量分别是0.335μg/mL和1.16μg/mL,比值为2.25倍。经重复实验验证B液提取的目的蛋白在总蛋白含量的百分比较A液所提取的高,具有统计学意义(P<0.05)。结论植物蛋白提取液B提取转基因番茄中外源目的蛋白较提取液A更为高效并且省时。
- 钱昱霏刘建国白国辉管晓燕韩琪白朋元
- 关键词：转基因番茄变异链球菌
- 转基因番茄可食防龋疫苗免疫BABL/c小鼠的实验研究
- 目的：用含编码变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄免疫BABL/c小鼠，检测其免疫原性.方法：BABL/c小鼠18只，随机分成3组，分别为转基因番茄果汁免疫组；变异链球菌灭活全菌免疫组；非转基...
- 顾瑜刘建国关薇薇杨德琴管晓燕韩琪张剑白国辉
- 关键词：转基因番茄
- 变异链球菌表面蛋白SpaP P区真核表达质粒的构建及表达被引量：3
- 2010年
- 背景:变异链球菌是龋病的主要致龋菌,针对介导变异链球菌非蔗糖依赖性黏附的重要毒力因子SpaP的基因疫苗在理论上能对抗变异链球菌黏附于牙面和进一步破坏牙体硬组织。目的:构建变异链球菌表面蛋白P区(SpaP/P)真核表达质粒pVAX1-spap/P,并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达。方法:通过基因重组技术,构建真核表达质粒pVAX1-spap/P,并经酶切分析、测序分析鉴定正确后,采用脂质体转染法,将其转染至COS-7细胞中,然后经免疫组织化学SABC法检测其在细胞中的表达。结果与结论:真核表达质粒pVAX1-spap/P经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切分析,证实携带1.2kb的目的基因spap/P片段,经测序分析,目的基因正向插入到预先设计的载体位点处。pVAX1-spap/P转染的细胞胞质呈褐色,pVAX1空载体质粒转染的细胞胞质中无着色。证实实验成功构建真核表达质粒pVAX1-spap/P,所携带的基因序列正确,能够在真核细胞COS-7中正确表达目的蛋白。
- 白国辉刘建国柴巧学曲云鹏管晓燕韩琪杨德琴
- 关键词：变异链球菌龋病表面蛋白PVAX1真核表达
- 嵌合体真核表达质粒pVAX1-SPG的构建及表达研究被引量：1
- 2015年
- 目的:构建含变异链球菌表面蛋白Spa P的P区编码基因spap-P和葡聚糖结合蛋白Gbp A的葡聚糖结合区编码基因gbd的嵌合体真核表达质粒p VAX1-SPG,并观察其在哺乳动物细胞293T中的表达。方法:通过基因工程技术构建嵌合体真核表达质粒p VAX1-SPG,并采用脂质体转染法将其转染至293T细胞中;然后分别采用免疫组化SABC法和Western-blot检测嵌合蛋白Spa P/P-GBD在真核细胞中的表达。结果:重组真核表达质粒p VAX1-SPG经酶切、测序鉴定证实,其所携带的外源基因片段为2.4 kb的目的基因片段,序列同源性为99%;免疫组化染色结果显示,经p VAX1-SPG转染的293T细胞胞质呈棕褐色染色;Western-blot检测结果显示,分子量为72 k Da的嵌合蛋白Spa P/P-GBD能够被正确表达。结论:构建成功的嵌合体真核表达质粒p VAX1-SPG能在真核细胞293T中正确表达目的蛋白。
- 王怡丹孙天瞳刘建国柴巧学曲云鹏于晓光白国辉田源韩琪
- 关键词：变异链球菌表面蛋白抗原葡聚糖结合蛋白真核表达
- 防龋用转基因番茄外源蛋白表达稳定性研究
- 2018年
- 目的:追踪检测转基因防龋可食番茄中外源蛋白的表达稳定性。方法:田间种植含有编码变异链球菌表面蛋白粘附功能A区(Cell surface protein antigen A, PAcA)、表面蛋白免疫活性P区(Cell surface pro-tein antigen P, PAcP)的外源基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的转基因番茄种子,获得连续的四代番茄植株F0,F1,F2,F3。在植株的开花坐果期,每七天提取样本,通过生物分子技术检测外源蛋白的表达。结果:1) 四代转基因番茄中含嵌合基因pacA-ctxB的植株中有31株表达外源蛋白;含pacP-ctxB的植株中有28株表达。2) 果实中外源蛋白PAcA/CTB占总蛋白的含量是:F0代0.248%,F1代0.088%,F2代0.103%,F3代0.078%;PAcP/CTB的含量是:F0代0.308%,F1代0.300%,F2代0.278%,F3代0.176%。3) 在开花坐果期的第6~8周,果实中外源蛋白PAcA/CTB含量分别为0.236%,0.276%,0.257%;PAcP/CTB为0.568%,0.600%,0.554%。结论:防龋疫苗中外源蛋白能够较稳定地表达,表达含量较高;PAcP/CTB的表达阳性率及含量均较PAcA/CTB高;外源蛋白在果实中的表达较叶片高;外源蛋白在坐果期的6~8周的表达最高;同株的不同果实同期表达含量及比重有差异。
- 邹怡然韩琪韩琪白朋元白国辉管晓燕陈筑白国辉刘建国
- 关键词：变异链球菌转基因番茄防龋疫苗
- 变异链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因在转基因番茄中的表达被引量：1
- 2014年
- 目的:在获得含编码变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄原代种子的基础上,应用分子生物学技术检测外源基因在转基因植株中的表达,测定目的蛋白的含量。方法:PCR筛选含编码变异链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄植株;提取番茄果实总蛋白,用BCA试剂盒测定番茄果实总蛋白含量;通过Western印迹检测外源蛋白的表达情况,并用ELISA法对外源目的蛋白含量进行测定。结果:PCR扩增分析可见1.6 kb特异性扩增条带,出现特异性条带的植株占总检测植株的55.6%;转基因番茄总蛋白含量为3.93 mg/mL,Western印迹结果显示,在PVDF膜上,约60 kD处出现特异性条带;ELISA测得表达的目的蛋白占番茄可溶性总蛋白的0.18%。结论:含编码变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄子代植株能有效表达外源蛋白。
- 顾瑜刘建国关薇薇陈筑白国辉唐琳管晓燕田源韩琪
- 关键词：变异链球菌霍乱毒素B亚单位转基因番茄
- 变异链球菌葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区真核表达质粒的构建及其在哺乳动物细胞中的表达被引量：3
- 2010年
- 目的:构建变异链球菌葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区的真核表达质粒pVAX1-GbpA/GBD,并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达。方法:利用基因重组技术构建真核表达质粒pVAX1-Gb-pA/GBD,经酶切分析和测序分析鉴定后,通过脂质体转染法,将其转染至COS-7细胞中,免疫组化SABC法检测其在细胞中的表达。结果:重组质粒pVAX1-GbpA/GBD经EcoR I和BamH I酶切证实携带1.2kb目的基因片段,经测序分析,目的基因正确插入到预先设计的载体位点处。pVAX1-gbpA/GBD转染的细胞胞质呈褐色染色,pVAX1空载体质粒转染的细胞胞质中无着色。结论:成功构建防龋基因疫苗真核表达质粒pVAX1-GbpA/GBD,所携带的基因序列正确,能够在真核细胞COS-7中正确表达目的蛋白。
- 韩琪刘建国柴巧学曲云鹏管晓燕白国辉杨德琴
- 关键词：变异链球菌哺乳动物细胞真核表达
- 表达嵌合体蛋白PAcA/CTB的转基因番茄口服免疫大白兔的实验研究被引量：11
- 2013年
- 目的:观察表达嵌合体蛋白PAcA/CTB转基因番茄防龋疫苗的免疫原性和免疫反应性。方法:新西兰大白兔随机分为实验组、阴性对照组和阳性对照组3组,分别喂食3个剂量(目的蛋白量相差1.5倍)的转基因番茄汁、非转基因番茄汁和变异链球菌灭活全菌疫苗。每周免疫1次,连续免疫4周,ELISA法检测免疫前和免疫后不同时期血液、唾液样品中抗变异链球菌PAc的IgG、IgA抗体效价。结果:口服免疫后实验组与阳性对照组大白兔血液和唾液中均出现特异性的抗PAc抗体,抗体水平可维持数周,而阴性对照组抗体水平变化不明显。结论:表达嵌合体蛋白PAcA/CTB的转基因番茄能够诱导动物机体产生有效的系统免疫应答和黏膜免疫应答。
- 田源刘建国白国辉陈筑韩琪白朋元顾瑜管晓燕钱昱霏
- 关键词：转基因番茄防龋疫苗变异链球菌
- 转基因番茄中外源目的基因检测方法的筛选被引量：1
- 2011年
- 目的用普通PCR和real-time PCR两种方法检测转基因番茄中的外源基因,通过优化条件建立一种灵敏、准确检测转基因番茄中外源基因的方法。方法以防龋用转基因番茄为实验材料,通过SDS和植物基因组DNA提取试剂盒两种方法提取植物总DNA,用普通PCR和real-time PCR检测转基因番茄中的外源目的基因。结果植物基因组DNA提取试剂盒提取样品在琼脂糖凝胶电泳图上出现单一条带,条带清楚无拖尾,而用SDS法检测时常会出现拖尾现象。用普通PCR法重复检测40株转基因番茄平均检出率为88.75%,出现假阴性结果,而用real-timePCR法检测相同样本未出现假阳性或假阴性结果,检出率为100%。结论植物基因组DNA提取试剂盒结合real-time PCR技术是检测转基因番茄中外源目的基因的一种准确、灵敏的方法。
- 白国辉田源白朋元韩琪刘建国
- 关键词：转基因番茄防龋疫苗REAL-TIMEPCRPCR
