杨刚刚
- 作品数：11 被引量：24H指数：3
- 供职机构：河南师范大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：河南省自然科学基金河南省科技攻关计划国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- 重组rHSA-hFGF21融合蛋白在毕赤酵母中的表达纯化及活性分析被引量：3
- 2022年
- 人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,hFGF21)已成为改善血糖和脂质代谢的候选药物,但却存在半衰期短和易被体内代谢等缺点,导致靶组织利用率低,限制了其临床应用。本研究通过柔性连接肽(GGGGS)_(3)将hFGF21的N端连接至人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的C端,经过毕赤酵母密码子优化后,将重组基因片段rHSA-hFGF21连入pPIC9k和pPICZαA两种载体,并转化到X33、GS115和SMD1168三种不同酵母菌株中。通过加压筛选得到高表达的X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21工程菌株,并优化摇瓶诱导条件如OD值、甲醇浓度和诱导时间进一步提高rHSA-hFGF21的表达效率。培养上清经中空纤维膜切向流技术粗分离、Blue亲和层析和Q离子交换层析纯化获得纯度约98.18%的rHSA-hFGF21蛋白。与hFGF21相比,rHSA-hFGF21具有更好的热稳定性和抗胰蛋白酶降解的能力,其血浆半衰期也延长了约27.6倍;中高浓度条件下rHSA-hFGF21刺激HepG2细胞摄取葡萄糖的能力优于hFGF21;在2型糖尿病动物中rHSA-hFGF21比hFGF21具有更好的长效降糖效果。本研究将为FGF21蛋白的大规模生产奠定基础。
- 黄甜甜齐剑英杨刚刚叶贤龙
- 关键词：融合蛋白毕赤酵母
- 豹蛙酶的抗肿瘤作用研究进展被引量：1
- 2012年
- 豹蛙酶(onconase)又称抗瘤酶、P30蛋白等,属核糖核酸酶A超家族成员。豹蛙酶是目前唯一用于临床试验阶段的核糖核酸酶,它的核糖核酸酶活性低,细胞毒性较强,对体内外多种肿瘤有很强的杀伤作用,是当前全球重点研究的100种新药之一。豹蛙酶在北极蛙的早期胚胎中被首次发现,它主要通过破坏RNA从而抑制蛋白质合成,诱导肿瘤细胞凋亡,此外还有其他抗肿瘤机制,如影响特定基因的表达和破坏端粒酶RNA。豹蛙酶和其他抗癌药物联合应用会增强抗癌药物的抗肿瘤细胞毒性。目前,豹蛙酶对小细胞肺癌和其他实体肿瘤的治疗处于Ⅰ期或Ⅱ期临床试验,对恶性间皮瘤的治疗处于Ⅲ期临床试验阶段,是潜在的治疗恶性间皮瘤的药物。
- 鲁艳平杨刚刚张瑞刚徐存拴
- 关键词：核糖核酸酶肿瘤细胞毒性
- 豹蛙抗瘤酶与维生素C协同促进大鼠肝癌RH-35细胞凋亡被引量：3
- 2020年
- 为了研究豹蛙抗瘤酶(ONC)与维生素C(VC)对肿瘤细胞的协同促凋亡作用,对大鼠肝癌RH-35细胞进行单药组和联合用药组处理。采用磺酰罗丹明B法测定细胞增殖抑制率,Hoechst染色检测细胞核变化。采用联合指数和等效线图解法评价联合用药效果,流式细胞法检测细胞的凋亡情况。试验结果表明:ONC单药组和VC单药组对RH-35细胞增殖的抑制作用均显著(P<0.01),联合用药组的促凋亡作用优于单药组(P<0.001)。VC协同ONC促进了RH-35细胞凋亡。
- 王泽郗玲玲郗玲玲梁新月杨刚刚
- 关键词：维生素C细胞凋亡
- 重组人白细胞介素-1α在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性检测
- 2015年
- 在毕赤酵母中分泌表达重组人白细胞介素-1α(rh IL-1α),优化rh IL-1α的发酵工艺及纯化方法,以获得高表达、高纯度具有生物学活性的rh IL-1α。通过PCR扩增获得h IL-1α基因,构建其真核表达载体p PICZαA/h IL-1α,电转化至毕赤酵母X-33,用PCR和SDS-PAGE方法筛选高效表达rh IL-1α的工程菌株并进行Western blot鉴定,DEAE弱阴离子离子交换层析一步纯化表达产物,并用MTT法初步检测其对人肝癌细胞7402的生物学作用。rh IL-1α在摇瓶规模下,经甲醇诱导4 d后表达量约为30 mg/L。Western blot检测rh IL-1α的特异性结合,获得纯度约95%,收率40%左右的rh IL-1α,并证明rh IL-1α能够抑制人肝癌细胞7402的增殖。构建了重组h IL-1α的基因工程菌,并在毕赤酵母中实现了高效表达,为进一步研究其生物学活性和功能奠定了基础。
- 李斌许晓亚杨刚刚崔晴晴杨亚娟徐存拴
- 关键词：毕赤酵母纯化人肝癌细胞
- 豹蛙抗瘤酶的毕赤酵母高效表达、纯化及活性测定被引量：1
- 2015年
- 豹蛙抗瘤酶(Onconase,ranpirnase,ONC)对体内外多种肿瘤有很强的杀伤作用,是当前全球重点研究的100种新药之一,为获得高表达与高活性的重组豹蛙抗瘤酶(Recombination onconase,rONC),根据成熟ONC的cDNA序列和毕赤酵母密码子偏好性设计基因并提高其GC含量,分泌信号肽采用酵母α交配因子的pre肽,分别构建表达载体pPIC9/ONC、pPIC9K/ONC和pPICZα-A/ONC,并转染毕赤酵母X-33、GS115和SMD1168,筛选阳性克隆并进行诱导表达。在摇瓶规模筛选最佳载体-宿主组合及优化培养条件之后,进行10 L规模最优培养基的筛选,发酵产物经双水相萃取偶联G50凝胶层析分离纯化。结果表明,pPICZα-A/X-33/ONC组合表达量优于其他组合,且在p H 5.5、23℃条件下诱导7 d,最高表达量达到13 mg/L;在10 L规模条件下,rONC于pH 5.5的低盐基础培养基(Lower basic salt medium,LBSM)、甲醇浓度0.25%条件下诱导7 d,最高表达量为180 mg/L;纯化后的rONC纯度≥95%,收率高于90%;生物活性检测发现,rONC在体外能杀伤多种癌细胞。初步建立了rONC的高效表达与纯化体系,为后续的功能和作用机理研究奠定了一定基础。
- 杨刚刚马诚凯张全义史世会王泽吕中原王绪洋许晓亚崔晴晴张继红张瑞刚徐存拴
- 关键词：双水相萃取活性测定
- 重组豹蛙抗瘤酶促进大鼠肝癌RH-35细胞凋亡被引量：1
- 2016年
- 目的研究重组豹蛙抗瘤酶(r ONC)对大鼠肝癌RH-35细胞增殖和凋亡的作用。方法用不同浓度的r ONC处理体外培养的RH-35细胞,用SRB法检测细胞增殖;Hoechst染色法测定细胞活性;用流式细胞术检测细胞周期;用qRT-PCR和Western blot法检测相关基因和蛋白的变化。结果 r ONC作用于RH-35细胞24 h后呈时间和浓度依赖性,显著抑制增殖(P<0.05),IC_(50)为7.38μmol/L。rONC作用于RH-35细胞后,细胞核出现了显著的凋亡特征。G0/G1期的细胞比例显著上升(P<0.05),增殖能力减弱。r ONC作用于RH-35细胞后,BAX mRNA和蛋白水平升高(P<0.05),而PCNA,CCNA2和BCL-2 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)。结论 r ONC可能通过上调BAX表达和下调PCNA,CCNA2和BCL-2表达,促进RH-35细胞凋亡,抑制细胞增殖。
- 许晓亚靳伟杨刚刚张全义吕中原秦艳丽徐存拴
- 关键词：大鼠肝癌细胞细胞凋亡
- 一株肠膜明串珠菌的分离鉴定及其抑菌特性被引量：6
- 2021年
- 【背景】水产病原细菌严重威胁水产动物健康且制约水产养殖业发展,细菌性鱼病的有效防治成为水产养殖领域亟待解决的问题。【目的】筛选对水产病原细菌有抑制效果的菌株,并研究其抑菌特性及其在水产细菌病害防治中的实际效果。【方法】通过16S rRNA基因测序、构建系统发育树和生理生化鉴定确定筛选菌株的进化地位,通过乙酸乙酯萃取获得抑菌物质粗提物,通过偶氮酪蛋白法检测菌株胞外蛋白酶活力,采用结晶紫染色法对菌株的生物膜形成能力进行测定,通过浸浴攻毒模型确定所筛菌株对维氏气单胞菌的防治作用。【结果】从泡菜发酵物中筛选出一株乳酸菌DH,经16SrRNA基因测序、发育树分析和生理生化鉴定确定其为肠膜明串珠菌,该菌分泌的胞外抑菌物质对鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、杀鲑气单胞菌、希瓦氏菌和维氏气单胞菌表现出抑菌效果,其抑菌物质能被乙酸乙酯萃取并且具有热稳定性。菌株DH能够显著抑制待测菌株的蛋白酶产量和生物膜形成能力,并且对维氏气单胞菌浸浴攻毒有防治作用。【结论】肠膜明串珠菌DH通过分泌抑菌物质抑制水产病原细菌的生长,能够为细菌性鱼病的防治提供一定的理论和应用潜力。
- 李祎吴晓敏杜航景如贤杨刚刚
- 关键词：肠膜明串珠菌抑菌物质
- 基于MaxEnt模型对重要药用植物猫爪草潜在适生区的预测被引量：3
- 2022年
- 基于猫爪草的140个分布位点和10个环境变量,采用最大熵模型(MaxEnt)和地理信息系统(GIS)对猫爪草在我国的适生区进行预测。结果表明,ROC曲线面积AUC值为0.92,说明模型预测结果可靠;猫爪草在我国的高度适生区主要集中在长江流域平原各省区,包括河南省南部、安徽省中南部、江苏省南部、上海、浙江省东部和北部、江西省北部、湖北省南部、湖南省中部以及重庆的部分地区和台湾北部,面积约占我国土地面积的3.3%;影响猫爪草分布的主导环境因子与降水和温度有关,包括3月份降水量、降水量季节变化、等温性和温度季节性变化标准差。这些结果与猫爪草的实际分布和生物学特性相吻合,可为其推广种植提供参考。
- 谢艳萍杨刚刚张兴旺
- 关键词：猫爪草最大熵模型地理信息系统药用植物
- IL-18的毕赤酵母表达及其激活NF-κB和p38途径促进BRL-3A细胞增殖
- 2015年
- 目的：探讨白细胞介素18（IL-18）在毕赤酵母中的表达条件及其对BRL-3A细胞的增殖作用和作用机制.方法：构建表达载体p PIC9K-IL-18,电转化至毕赤酵母GS115,PCR、Western blotting和SDS-PAGE方法鉴定表达产物的正确性,并对发酵条件进行优化,再经双水相萃取偶联DEAE离子交换层析分离纯化表达产物.然后,MTT法检测重组大鼠IL-18（rr IL-18）对BRL-3A细胞的增殖作用,RT-PCR和Western blotting方法检测IL-18信号通路相关基因的表达变化.结果：在3 L发酵罐规模下600的菌体密度、p H=6.0、诱导温度23℃、体积分数分别为20%DO和0.25%甲醇浓度条件下表达质量浓度最高约为280 mg/L,经分离纯化后纯度可达95%.此外,质量浓度为15-20 ng/m L rr IL-18孵育48 h,能明显促进BRL-3A细胞增殖（P〈0.5）,且IL18R、My D88、NF-κB及其下游靶蛋白cyclin B1和cyclin B2的表达量均显著高于对照组（P〈0.5）.同时,p38途径的ATF2及其下游靶蛋白cyclin A2和Bcl-2的表达量也随之升高（P〈0.5）.结论：成功构建大鼠IL-18表达载体,优化在毕赤酵母中的发酵条件和纯化工艺,并首次证实IL-18能通过NF-κB和p38/ATF2途径激活细胞增殖相关靶蛋白cyclin B1、cyclin B2、cyclin A2和Bcl-2,进而促进BRL-3A大鼠肝细胞增殖。
- 张继红许晓亚杨刚刚马诚凯徐存拴
- 关键词：白细胞介素18毕赤酵母双水相萃取细胞增殖
- 豹蛙抗瘤酶与人血清白蛋白融合蛋白的毕赤酵母高效表达与活性测定被引量：4
- 2015年
- 豹蛙抗瘤酶(Onconase,ONC),又称豹蛙酶,对多种肿瘤细胞和实体瘤具有显著杀伤作用,为得到高表达的ONC,利用HSA在毕赤酵母系统中的表达优势,将HSA和ONC融合进行毕赤酵母表达并分离纯化。设计融合基因HSA-(Gly4Ser1)3-ONC,简称HSA-ONC,构建至3种表达载体p PIC9、p PIC9K、p PICZα-A并分别转染X-33、GS115和SMD1168 3种宿主菌,在摇瓶和10L规模优化表达条件和双水相偶联柱层析分离纯化目的蛋白并测定其生物学活性。结果显示,在1 L摇瓶规模下,p PICZα-A/X-33/HSA-ONC组合的表达量优于其他组合,且在p H7,温度23℃条件下诱导10 d,表达量达到最高(235 mg/L)。在10 L规模进行不同培养基条件的发酵,r HSA-ONC于p H 7的低盐基础盐培养基(Low salt basic salt mediu m,LS-BSM),甲醇浓度0.25%条件下诱导10 d,表达量达到最高(2.02 g/L)。经双水相萃取偶联DEAE离子交换层析可得到纯度≥95%、收率高于70%的r HSA-ONC。生物活性检测发现,r HSA-ONC在体外能抑制多种癌细胞增殖。r HSA-ONC的表达量较r ONC提高1倍(同等摩尔量情况下),同时在体外抑制多种癌细胞增殖。
- 杨刚刚马诚凯史世会张全义王泽吕中原王绪洋许晓亚崔晴晴张继红丁一徐存拴
- 关键词：双水相萃取
