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王立峰: 作品数：22 被引量：157H指数：7; 供职机构：第四军医大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金军队“十五”科研基金国家杰出青年科学基金更多>>; 相关领域：生物学医药卫生更多>>

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NDRG家族成员酵母双杂交诱饵载体的构建,表达及自激活检测被引量：3: 2005年; 目的:构建NDRG家族4个成员的酵母双杂交诱饵载体,验证其在酵母中的表达并检测其自激活作用,为用酵母双杂交方法寻找与NDRG家族相互作用的分子奠定实验基础.方法:用PCR方法获得NDRG家族4个成员cDNA全长,将4个片段按正确读框插入酵母表达质粒PGBKT7中,经限制性酶切鉴定正确后,PEG/LiAc法转化酵母菌株AH109, Western验证4个分子的正确表达,用表型筛选法及颜色筛选法检测其自激活作用.结果:构建了NDRG家族4个成员的酵母双杂交诱饵载体,并在酵母中正确表达,除NDRG4 B外 NDRG1,2,3均无自激活作用.结论:NDRG1,2,3可以用酵母双杂交方法钓取与之相互作用的分子.NDRG4 B由于有自激活作用不能用于酵母双杂交的筛选.; 张璟张健刘娜王立峰李霞刘新平药立波; 关键词：诱饵载体酵母双杂交自激活作用

虎仗提取物白藜芦醇诱导胃癌细胞HGC27凋亡被引量：8: 2004年; 目的 :观察虎仗提取物白藜芦醇对胃癌细胞HGC2 7细胞周期和增殖的影响及凋亡诱导作用 .方法 :采用MTT法和软琼脂集落形成实验观察白藜芦醇对细胞增殖的影响 ,Annxin V&PI染色及流式细胞仪检测观察白藜芦醇对细胞周期的影响及诱导凋亡的作用 .结果 :MTT实验发现白藜芦醇作用HGC2 7细胞 2 4h后 ,细胞存活率显著下降 (P <0 .0 1)并呈剂量依赖性 ,软琼脂集落形成实验发现HGC2 7细胞在0 .5mmol/L白藜芦醇作用下无细胞集落的形成 ,Annxin V&PI染色及流式细胞仪检测发现白藜芦醇可引起HGC2 7阻滞于G1期 ,并可诱导HGC2 7发生凋亡 (8.39% ) .结论 :白藜芦醇可抑制胃癌细胞HGC2 7增殖并可诱导细胞发生凋亡 .; 李莹药立波王立峰韩炯韩月恒刘新平林树新俞强; 关键词：白藜芦醇凋亡胃肿瘤肿瘤细胞

pWPT-GFP慢病毒载体的改构及鉴定被引量：3: 2010年; 目的:为实现慢病毒感染后可用抗生素筛选外源基因稳定整合的细胞,我们对慢病毒载体质粒(pWPT-GFP)进行了改构。方法:将三种抗生素抗性基因(puro、hygro、neo)连同其启动子分别克隆入慢病毒载体(pWPT-GFP)。酶切鉴定载体构建正确后,将这三种改构载体分别与辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T包装细胞,收获病毒上清并感染靶细胞,使用相应抗生素筛选细胞验证抗性基因的插入。结果:成功构建了重组慢病毒载体pWPT-GFP-puro、pWPT-GFP-hygro、pWPT-GFP-neo,通过调整病毒上清的用量可以达到靶细胞100%的感染效率;用相应抗生素筛选细胞证明了抗性基因的表达。结论:我们成功改构了慢病毒载体(pWPT-GFP),从而使病毒感染后用抗生素筛选稳定整合的细胞成为可能。; 韩腾龙王立峰张璟刘新平药立波; 关键词：慢病毒载体改构

TRP-1 B细胞表位区在酵母中的表达纯化及生物学活性研究被引量：5: 2004年; 目的　为进一步探索酪氨酸酶相关蛋白 -1(TRP 1)人源B细胞表位 ,利用甲醇营养型酵母Pichiapas toris表达系统表达TRP 1的B细胞表位区。方法　将本实验室已构建好的质粒 pUC19/TRP 1进行双酶切 ,将目的片段亚克隆至带有 6His标签的 pRSETA载体 ,将 6His融合的TRP 1整体PCR扩增出来 ,克隆到酵母表达载体pPIC3 .5K上 ,构建成重组质粒 pPIC3 .5K/6His TRP1。该质粒转化酵母菌GS115 ,经G418筛选得到高拷贝转化子。转化菌体经Mut表型鉴定后 ,用含 0 .5 %甲醇的培养基诱导表达 ,表达产物利用Ni NTAagarose柱通过金属螯合亲和层析进行纯化后 ,测定其生物学活性。结果　通过 4天的诱导 ,该系统成功表达了 6His TRP1蛋白 ,经亲和层析纯化后扫描分析重组蛋白分子量约为 18kD ,纯度可达 96%。Westernblotting及ELISA实验证实 ,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有结合白癜风病人IgG的能力。结论　在Pichiapastoris表达系统中 ,获得了具有生物学活性的可溶性重组TRP 1的B细胞表位肽段 ,为深入研究TRP -1人源表位及白癜风的发病机制、免疫治疗及恶性黑素瘤的免疫治疗奠定了基础。; 李廷慧高天文李春英李毅张文红王立峰李立文孙东杰刘玉峰; 关键词：B细胞表位酵母生物学活性白癜风

ndrg2 mRNA在人胎脑组织中表达的时空特点被引量：5: 2008年; 本研究利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测了ndrg2 mRNA在人胎脑组织中表达的时空特点,为进一步研究其功能提供实验依据。收集正常引产16～28周人胎脑组织标本,进行总RNA提取,应用RT-PCR方法半定量分析ndrg2基因在上述人胎脑组织中的表达水平和变化规律。RT-PCR结果显示:ndrg2 mRNA在正常人胎脑16、20、24和28周的各脑功能区均有表达,但随着发育,其表达水平有差别。在小脑、延髓和海马等部位,ndrg2 mRNA的表达水平在16周胎脑中较高。而在额叶和顶叶等部位,ndrg2 mRNA的表达水平在28周胎脑中达到高峰。以上结果表明,在人胚脑发育过程中ndrg2 mRNA从16～28周均有表达,但在不同脑后其表达存在一定差异,提示ndrg2基因对中枢神经系统的发育和成熟可能有重要影响。; 侯双兴王立峰邓艳春刘新平张健刘娜; 关键词：NDRG2 RT-PCR 胎脑

人NDRG1的融合表达、纯化及抗体制备被引量：4: 2003年; NDRG1是在N myc缺陷的小鼠胚胎组织中发现的一异常高表达的新基因 .在研究高同型半胱氨酸血症引起动脉粥样硬化的机制时 ,在培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)中发现了人NDRG1 .为了研究人NDRG1的功能以及结构与功能之间的关系 ,用RT PCR技术 ,从人脑总RNA中克隆NDRG1cDNA ,进行序列测定后 ,将NDRG1插入pPROEXHTb表达载体中 ,转化E .coliDH5α感受态细胞 ,并在LB培养基中获得高效可溶表达 .表达的 6His NDRG1融合蛋白经Ni2 + NTA偶联的琼脂糖珠纯化 ,通过圆二色性分析其二级结构 ,结果为 :α螺旋 :2 3 6 ,β片层 :1 8 6 ,转角 :2 5 7,无规卷曲 :32 0 .用此融合表达的蛋白免疫家兔 ,制备得到高效价的抗体 ,利用固定于硝酸纤维素膜上的NDRG1抗原亲和吸附纯化抗血清提高了抗体的特异性。; 张健刘新平张伟吴国强沈岚王立峰苏金张万会药立波; 关键词：圆二色性免疫血清抗体制备 NDRG1基因

RNAi引起的Paxillin和p130Cas下调抑制胃癌细胞失巢性生长被引量：16: 2005年; P130Cas和paxillin分子是整合素家族下游重要的衔接分子.为了探索这两个分子在肿瘤细胞抗失巢凋亡中的作用,应用RNAi技术分别抑制抗失巢凋亡的胃癌细胞BGC82 3中paxillin和p130cas基因的表达,观察它们对细胞失巢性生长的影响.依据siRNA设计原则,分别设计针对p130cas和paxillin的两条序列;成功的构建了特异性封闭上述两分子的载体pWH1 p130cas和pWH1 paxillin .构建的载体瞬时转染贴壁培养和失巢培养的BGC82 3后,RT PCR和Western印迹检测发现paxillin和p130Cas分子在mRNA及蛋白水平的表达量均明显降低;倒置显微镜下观察发现,贴壁培养的胃癌细胞发生皱缩、脱落;失巢培养的细胞聚集成团的现象受到明显抑制,细胞团比对照组小,且较松散;MTT实验结果表明,失巢培养的BGC82 3pWH1 paxillin 组细胞存活率(32 19%±6 11% )和BGC82 3pWH1 p13 0cas组细胞存活率(2 8 5 2 %±5 0 2 % )与对照组相比显著下降(P <0 0 1vscontrol) ;FCM实验结果发现与失巢培养的对照组相比,BGC82 3pWH1 paxillin和BGC82 3pWH1 p13 0cas组细胞G1期抬高,并出现了凋亡峰.运用RNAi技术分别抑制了BGC82 3细胞中paxillin和p130Cas分子的表达,初步证明paxillin和p130Cas是细胞存活的重要信号分子,在肿瘤细胞抗失巢凋亡过程中具有重要的作用.; 李莹药立波刘新平王立峰韩月恒林树新俞强

白藜芦醇诱导胃癌细胞脱落凋亡被引量：7: 2004年; 目的研究白藜芦醇诱导胃癌细胞脱落凋亡的作用。方法采用细胞形态学观察、Annxin-V和PI细胞染色和流式细胞仪检测,观察白藜芦醇(0.1、0.2、0.5 mmol/L)对脱落培养胃癌细胞B(3C823、SGC7901和HGC27的生长状态、细胞周期的影响及诱导脱落凋亡的作用。结果倒置显微镜下发现脱落培养的胃癌细胞聚集成团生长,0.1 mmol/L白藜芦醇作用细胞后可抑制抗脱落凋亡的胃癌细胞聚集成团;流式细胞仪检测和Annxin-V和PI细胞染色表明0.5 mmol/L白藜芦醇可分别阻滞脱落培养的BG(2823、SGC7901和HGC27细胞于G0/G1、S、G2/M期,并可诱导这3株胃癌细胞发生脱落凋亡,其中自藜芦醇诱导HGC27细胞脱落凋亡比例达19.3％,远高于其他两株胃癌细胞。结论白藜芦醇可诱导胃癌细胞发生脱落凋亡。; 李莹药立波王立峰韩炯韩月恒刘新平林树新俞强; 关键词：白藜芦醇胃癌细胞

蛋白激酶B的PH结构域可溶性表达与纯化及其二级结构分析被引量：2: 2003年; The serine/threonine protein kinase B(PKB) is related to cellular survival and regulation. PKB is composed of PH domain, catalytic domain and carboxyl terminal regulator domain. The PH domain of PKB is crucial to the activation of kinase. In order to investigate the function and the structure function relationship of PKB, the cDNA coding fragment of PKB PH domain was amplified from human dental pulp mRNA by RT PCR and cloned into pMD18 T vector to analyze the sequence. The result showed that DNA sequence of cloned human PKB PH domain was consistent with that reported previously. To express PKB PH domain, the cDNA was subcloned into expression vector pRSET A which was then transformed into E.coli BL21(DE3) pLysS, and the strain highly expressing soluble 6His PKB PH domain in minimal medium was obtained. The fusion protein was purified by Ni 2+ NTA agarose beads. The secondary structure of the purified 6His PKB PH domain fusion protein was analysed by circular dichroism. The results indicated that the PH domain was composed of α helix 1 7%,β pleated sheet 80 5% and radom coli 17 8%.; 沈岚季少平刘新平王吉村王立峰苏金药立波; 关键词：蛋白激酶B PH结构域可溶性表达纯化

抑癌候选基因NDRG2在乳腺肿瘤组织及乳腺癌细胞系中的表达分析被引量：27: 2004年; 目的 :分析抑癌候选基因NDRG2在人类乳腺肿瘤组织及乳腺癌细胞系中的表达情况 .方法 :收集 4种乳腺癌细胞系及 2 1例乳腺肿瘤组织及其癌旁组织 ,提取总RNA ,应用半定量RT PCR及RNA斑点杂交的方法检测NDRG2mRNA的表达水平 .为进一步分析Ndrg2蛋白质的表达水平 ,分别提取 2 1例组织及细胞系的总蛋白 ,应用蛋白印迹技术检测其Ndrg2的蛋白表达水平 ,同时运用免疫组化的方法检测 4种乳腺癌细胞系中Ndrg2的表达情况 .结果 :RT PCR结果显示 ,4种乳腺癌细胞系中 ,有 3种NDRG2mRNA水平明显降低 .2 1例乳腺肿瘤组织中 ,有 5例NDRG2的mRNA水平明显降低 .蛋白印迹结果显示 ,筛选出的 3种低表达NDRG2mRNA乳腺癌细胞系中 2种Ndrg2的蛋白表达明显降低 ,而有 1种Ndrg2的蛋白表达没有变化 .2 1例乳腺肿瘤组织中发现 5例Ndrg2的蛋白水平明显下降 ,与RT PCR检测结果一致 .免疫组化结果显示 ,4种乳腺癌细胞系中 ,2种细胞系Ndrg2的表达水平明显降低 ,1种细胞系Ndrg2表达水平没有明显变化 ,与蛋白印迹结果一致 .结论 :Ndrg2在某些乳腺肿瘤组织和乳腺癌细胞系中呈低表达 ,提示其可能对乳腺肿瘤的发生或发展有重要作用 ,这不仅为研究乳腺癌的发病机制进一步提供了线索。; 刘娜刘新平王立峰张健王晓斌药立波; 关键词：NDRG2 乳腺肿瘤逆转录聚合酶链反应印迹法

王立峰

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