赵永坤
- 作品数：96 被引量：186H指数：7
- 供职机构：中国农业科学院更多>>
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- 相关领域：医药卫生农业科学生物学文化科学更多>>
- 犬科和/或猫科动物疫病重组活载体疫苗的制备方法
- 本发明提供了一种基于RNA病毒拯救技术的，制备犬科和/或猫科动物疫病重组活载体疫苗的方法，其基于反向遗传操作系统构建了可表达犬科和/或猫科动物疫病主要保护性抗原的重组病毒表达载体。利用该表达载体和辅助质粒共同转染狂犬病病...
- 杨松涛王化磊金宏丽冯娜赵永坤郑学星高玉伟王承宇王铁成黄耕夏咸柱
- 文献传递
- 犬瘟热病毒囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及鉴定被引量：1
- 2015年
- 为表达具有天然构象的犬瘟热病毒(CDV)囊膜糖蛋白融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H),本研究扩增小熊猫源CDV驯化致弱株LP的F、H基因,克隆至pFastBacTM1载体中,测序验证后转化至DH10BacTM感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒rBacmid-F、rBacmid-H,将其分别转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB-F、rpFB-H,并将表达的重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH)进行IFA和Western blot鉴定。以犬抗CDV高免血清对重组杆状病毒感染细胞进行IFA鉴定,在感染细胞的细胞膜上可见特异性荧光反应;以鼠抗F、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体对重组杆状病毒感染细胞进行Western blot检测,可见相对分子质量为63和68ku左右的条带,分别为重组融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH),大小与预期相符。两种囊膜糖蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中均成功表达,且具有良好的反应原性。本研究为CDV病毒样颗粒疫苗的开发等工作奠定了基础。
- 虞一聪冯娜闫飞虎盖微微王铁成王化磊郑学星赵永坤黄耕杨松涛高玉伟夏咸柱
- 关键词：犬瘟热病毒融合蛋白血凝素蛋白
- PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒致病性的影响分析被引量：1
- 2013年
- 目的利用A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,评估PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性,探究A/H6N1流感病毒的致病性分子基础。方法通过A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/San-Jiang/275/2007株反向遗传操作系统和点突变技术拯救病毒rA/H6N1和PB2 E627K位点发生突变的rA/H6N1-627,两株拯救病毒分别以101EID50～106EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、死亡率、病毒滴定等方面进行致病性分析。结果成功构建A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,rA/H6N1的8个基因片段完全源于A/H6N1的基因组,核苷酸序列及生物学特性与A/H6N1完全一致。rA/H6N1能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性(MLD50>106.5EID50),病毒在小鼠体内的分布情况及各个脏器中的病毒滴度与A/H6N1保持一致;rA/H6N1-627能感染小鼠,引起小鼠体重下降,但不能引起所有106EID50组小鼠死亡,病毒能在小鼠的肺脏和脑部进行增殖。结论实验结果表明,在H5N1禽流感中发挥重要作用的PB2-E627K位点并非A/H6N1流感病毒的毒力决定因子。A/H6N1流感病毒致病性的分子基础还有待继续研究,该反向遗传操作系统和点突变技术的建立为研究该亚型流感病毒致病机制、传播机制及病毒基因功能奠定了基础,同时也为A/H6N1亚型禽流感病毒新型疫苗的研制开辟了新途径。
- 程凯慧于志君忻悦张坤黄靖岳秀芳丁洁杨霞乔军王铁成杨松涛黄耕赵永坤高玉伟华育平夏咸柱
- 关键词：反向遗传操作生物学特性
- 科技期刊对实验动物描述要求的调查分析及其规范建议被引量：1
- 2016年
- 【目的】规范生命科学研究领域及航天、航海、防原、防化等特殊领域的科学研究中,科研论文涉及实验动物科学描述规范,以保证结果的科学性和可重复性。【方法】通过文献检索、网站浏览等方式调查了40多种国内外科技期刊投稿指南中对实验动物描述的要求。【结果】国外SCI期刊对实验动物描述要求跟期刊特色密切相关,差异较大,且具有针对性。我国期刊对实验动物描述的要求相对统一,多为简单照搬,实用性不强。提出了科技论文中实验动物描述规范。【结论】各相关期刊应根据各自专业特色,把对实验动物描述的有关要求写入投稿指南,便于作者在投稿前阅读并进行符合科学的实验设计。
- 李继平赵永坤孔琪
- 关键词：科研论文实验动物动物实验
- 犬瘟热病毒检测方法研究进展被引量：6
- 2012年
- 犬瘟热病毒属副粘病毒科麻疹病毒属成员,食肉目各科动物均有感染报道,但主要感染犬、狼、貂、狐等动物,发病率、死亡率较高,给养殖业带来巨大的经济损失。因此注射疫苗、尽早诊断本病并及时采取相应的防治措施是减少损失的有效手段。本文阐述了犬瘟热病毒的检测方法,以期为该病毒的研究提供参考。
- 李天松王磊王胜乐姜雪许微微李元果高玉伟王铁成王铁成赵永坤黄耕
- 关键词：犬瘟热病毒血清学PCR
- 生物反应器用加样口针头封闭器
- 本实用新型提供一种生物反应器用加样口针头封闭器，由右端盖、筒体、连接盖、密封盖及橡胶垫构成，筒体的一端通过螺纹连接有右端盖及橡胶垫，右端盖的中部设有针孔；筒体的另一端通过螺纹连接有橡胶垫、连接盖，连接盖的中部设有用于针头...
- 黄耕钱军万忠海高玉伟夏志平杨松涛王承宇赵永坤周博赵思言刘琳娜王铁成张国利王化磊郑学星夏振强李明银常琳黄靖孟轲音何扬夏咸柱
- 文献传递
- H5N1亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的表达鉴定及免疫原性研究被引量：5
- 2016年
- 目的为了获得H5N1HA蛋白,利用昆虫杆状病毒表达系统表达了A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(clade2.3.2.1)的HA基因并获得重组H5N1亚型流感病毒HA蛋白。方法将H5N1亚型2.3.2.1谱系的HA蛋白基因扩增并克隆到pFastBacⅠ载体中,构建重组穿梭质粒,转染昆虫sf9细胞后获得重组杆状病毒,对大量培养后表达的H5N1HA蛋白进行SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光检测。分别在0d和14d用纯化的表达产物HA蛋白免疫小鼠,免疫两周后进行H5N1攻毒试验,记录小鼠体重变化率及生存率。结果测序鉴定重组表达载体构建正确;SDS-PAGE显示纯化的表达蛋白分子质量为65ku;Western blot分析该蛋白能够被兔抗流感病毒IgG识别;鸡抗流感病毒抗体间接免疫荧光法测定HA蛋白的表达,在感染HA的昆虫细胞中出现特异性荧光;攻毒试验表明HA蛋白能够在小鼠体内诱导产生免疫应答并且保护H5N1流感病毒的致死性攻击。结论成功的表达了H5N1的HA蛋白,并且此HA蛋白能成功的诱导小鼠体内的免疫反应,并起到良好的保护作用。
- 孟令楠任志广冀显亮于竟杰李元果李胜楠于志君孙伟阳国娇赵永坤王铁成冯娜王化磊杨松涛高玉伟夏咸柱胡桂学
- 关键词：流感病毒疫苗杆状病毒表达系统
- 我国2株野生动物源细小病毒VP2和NS1基因序列及所编码蛋白的分析被引量：3
- 2013年
- 为了解我国野生动物源细小病毒VP2、NS1基因序列和进化特点,用PCR方法获得貉源细小病毒CR86106和猴源细小病毒BJ-22的目的基因片段,对其核苷酸和氨基酸序列进行测定分析。结果显示CR86106和BJ-22细小病毒基因组长均为4 269nt,其中NS1基因全长2 007nt,共编码668个氨基酸;VP2基因全长1 755nt,共编码584个氨基酸。CR86106VP2蛋白除第300位氨基酸为脯氨酸(P)以外,其余关键氨基酸位点均与猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus,FPLV)一致;BJ-22VP2蛋白除第323位为天冬酰胺(N)、第564位为丝氨酸(S)以外,其余关键氨基酸位点均与FPLV一致。CR86106NS1蛋白氨基酸序列与细小病毒参考毒株的相似性是98.4%～99.3%,VP2是97.6%～99.7%;BJ-22NS1蛋白氨基酸序列与细小病毒参考毒株的相似性是98.5%～99.4%,VP2是98.1%～99.3%。种系发生分析结果显示,CR86106VP2和NS1与FPLV亲缘关系较近;BJ-22NS1归到CPV分支,VP2归到FPLV分支且单独分在一支。结果表明,CR86106具有FPLV样细小病毒序列特征,BJ-22具有FPLV和CPV重组病毒特征,为猴源细小病毒的重组现象,研究结果同时也证实了基因重组在FPLV进化过程中起重要作用的推论。
- 梁萌梁萌王化磊冯昊胡桂秋金宏丽胡桂秋冯娜郭鹤张仁舟齐瑛琳冯娜郑学星张仁舟
- 关键词：细小病毒NS1基因VP2基因
- 一种基于凝胶过滤层析的水疱性口炎病毒(VSV)的纯化方法
- 2022年
- 本研究目的是开发出一套简单有效的水疱性口炎病毒(VSV)的纯化方法,该方法可为基于VSV的医用治疗平台相应的载体,也可为疫苗及溶瘤剂的研发提供一定的技术支撑和物质储备。选用BHK细胞作为VSV复制的载体,并通过显微镜观察细胞病变(CPE)的出现;应用凝胶过滤层析法对收获且处理过的病毒液进行纯化,包括第1轮饱和硫酸铵沉淀高盐除杂和第2轮以严格的吸收峰洗脱为特色的凝胶过滤层析的进一步纯化。通过SDS-PAGE、Western blot、ELISA、电镜验证等分析纯化产物的纯度和准确性。SDS-PAGE显示本方法明显除去病毒上清中大部分杂质;Western blot、ELISA、电镜证实纯化产物是VSV病毒。经使用Reed-Muench法计算病毒的半数组织细胞感染量(TCID)效价为10,RT-PCR的方法鉴定毒株为印第安纳毒株(Indiana, IN)。上述结果表明,本研究成功研制出一套方便、高效、简易的VSV纯化方法,为VSV的纯化和使用提供了参考依据。
- 孙赫岳玉环赵永坤吴广谋田园张守峰张国利李泽鸿
- 关键词：VSV凝胶过滤层析透射电镜
- 尼帕病毒截短G蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立
- 2023年
- 以截短的尼帕病毒(NiV)G基因原核表达产物为抗原建立检测尼帕病毒抗体的间接ELISA检测方法。对编码尼帕病毒G蛋白基因的部分序列进行扩增,将扩增获得的目的片段克隆至原核表达载体pET-30a(+),并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。菌落PCR鉴定后,在最佳诱导条件下表达目的蛋白。用Ni-NTA柱纯化截短的G蛋白,并进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。以纯化的蛋白为抗原建立尼帕病毒抗体间接ELISA检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性、稳定性进行验证。结果显示:成功构建重组质粒pET-30a(+)-NiV-G;表达的尼帕病毒截短G蛋白分子质量为50 ku,与预期值相符;截短的G蛋白能被His-tag抗体、抗尼帕病毒G蛋白粗提IgG识别。以该蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法检测已知阳性血清尼帕病毒抗体效价为1︰20480,裂谷热病毒、西尼罗病毒及克里米亚-刚果出血热病毒阳性马血清的检测结果均为阴性,且该方法批内、批间试验变异系数均小于10%。结果表明,成功构建了重组质粒pET-30a(+)-NiV-G,并诱导表达尼帕病毒截短G蛋白。以该蛋白建立的尼帕病毒抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、灵敏性、稳定性,可用于尼帕病毒疫苗免疫效果的评价、尼帕病毒病的监测及尼帕病毒抗体检测试剂盒的研发。
- 王琼王琼张颖张颖张颖冯娜王开赵永坤
- 关键词：尼帕病毒间接ELISA原核表达
