高冬妮
- 作品数：63 被引量：34H指数：3
- 供职机构：黑龙江大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金黑龙江省自然科学基金教育部留学回国人员科研启动基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生文化科学更多>>
- 构建具有巨细胞病毒(CMV)启动子的杆状病毒高效表达载体并利用其在鸡胚原代细胞中表达eGFP基因被引量：1
- 2013年
- 【目的】杆状病毒载体在哺乳动物细胞中不复制,具有极高的生物安全性,而通过引入细胞特异性启动子、"病毒假型化"、添加不同功能调控元件等优化手段,杆状病毒可转导的细胞类型明显增多、转导效率明显增高。优化的重组杆状病毒可以在鸡细胞中表达,确定重组杆状病毒在鸡细胞中高效表达的条件,为禽类基因工程疫苗的开发奠定了坚实的基础。【方法】本研究以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Protein,eGFP)为报告基因,构建含巨细胞病毒(Cytomegaoviyns,CMV)启动子启动的重组转座载体,并且通过病毒假型化(TM/CTD of VSV-GED)、添加转录后调控元件(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE)和腺病毒反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITRs)等手段优化重组杆状病毒表达载体,最终利用重组杆状病毒对鸡胚原代细胞的侵染进行eGFP的表达,比较分析不同重组载体对蛋白表达水平的影响。【结果】eGFP表达结果显示,12 h便可在倒置荧光显微镜下检测出eGFP的表达,随着时间的延长,eGFP表达效率先增加后降低。经过VSVGED病毒假型化的重组杆状病毒转导效率从36%增加至48.2%。添加转录后调控元件WPRE的重组杆状病毒介导eGFP的表达效果与添加10mmol/L丁酸盐法基本相同,但对细胞几乎没有毒性。从72 h内的eGFP表达强度看,只有添加ITRs元件的重组杆状病毒的表达强度随时间的延长而极缓慢增加。【结论】eGFP表达结果显示,利用VSVGED病毒假型化手段可以提高杆状病毒转导鸡胚原代细胞的效率;添加转录后调控元件WPRE的重组杆状病毒介导eGFP的表达效果与添加丁酸盐法基本相同,可以增强杆状病毒介导报告基因在鸡胚原代细胞中的表达水平;添加ITRs元件的重组杆状病毒具有延长eGFP表达时间的作用。
- 宋姗姗葛菁萍李梅高冬妮金丽颖安琦平文祥楼庄伟
- 关键词：杆状病毒调控元件
- 鸡白细胞介素2的克隆及其序列分析
- 2017年
- 旨在从分子生物学角度进一步研究鸡免疫刺激因子白细胞介素2(IL-2),探究IL-2蛋白结构。根据GenBank发表的IL-2序列设计引物扩增IL-2基因,将其克隆到p GM-T载体后进行鉴定,鉴定正确的pT-IL-2重组质粒,然后对其进行序列分析。应用生物信息学软件对IL-2序列进行跨膜区、磷酸化位点、氨基酸序列、开放阅读框进行分析和IL-2蛋白的三级结构进行预测。核苷酸序列测定结果表明:IL-2基因片段为430 bp,编码143个氨基酸。生物信息学分析结果表明:本实验获得的IL-2基因编码的蛋白质中含有1个丝氨酸和3个苏氨酸,这可能成为蛋白激酶磷酸化的位点。IL-2蛋白可能在5~28位含有跨膜区。其蛋白二级、三级结构预测结果显示其属于亲水性蛋白,多为α-螺旋、β-转角和N端无规卷曲结构。该结果为IL-2的分子生物学探究奠定了基础。
- 白程乐申艳高冬妮于航平文祥葛菁萍
- 关键词：白细胞介素2基因克隆蛋白结构预测
- 杆状病毒介导的哺乳动物细胞基因转移及其影响因素被引量：1
- 2009年
- 杆状病毒作为优良的哺乳动物细胞基因转移载体已在基因治疗、疫苗开发、药物筛选以及基因调控研究等方面发挥巨大作用。但杆状病毒对哺乳动物细胞的嗜性不够广泛、转导效率和转基因表达水平偏低,以及表达持续时间短暂等问题制约其进一步发展,因此如何突破这个制约的瓶颈成为学者们新的关注焦点。针对以上问题,围绕杆状病毒介导哺乳动物细胞基因转移的各种影响因素进行综述。
- 李梅王昆葛菁萍高冬妮楼庄伟平文祥
- 关键词：基因转移哺乳动物细胞
- 产漆酶半知真菌Myrothecium verrucaria NF-08菌株的分离及产酶研究被引量：6
- 2015年
- 【目的】采集凉水国家级自然保护区原始森林土壤样品,分离产漆酶真菌并优化产酶条件,旨在开发产漆酶半知真菌种质资源,提高漆酶产量,为微生物漆酶扩大生产提供菌种资源和条件参数。【方法】以木质素磺酸钠为唯一碳源的无机盐培养基为富集培养基,在愈创木酚-PDA选择性平板上分离产漆酶真菌。利用ABTS[2,2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]和SGZ[4-羟基-3,5-二甲氧基-苯甲醛连氮,即丁香醛联氮]显色反应初筛和摇瓶发酵复筛。确定供试菌株后,利用形态观察结合r DNA-ITS序列分析技术,将菌株鉴定至种。以ABTS法测定供试菌发酵液漆酶活性,以Lowry法测定发酵液总蛋白含量。在考察供试菌株生长、产酶及胞外蛋白总量动态变化基础上,通过单因素试验,研究碳源种类及浓度、氮源种类及浓度、培养基起始p H、装液量、接种量及底物诱导对菌株产漆酶的影响,获得菌株产酶最适培养基组分和培养条件参数。【结果】获得1株发酵周期短、初始酶活高的产酶菌株NF-08。结合形态学特征与r DNA-ITS序列分析结果,鉴定菌株NF-08属于为半知菌亚门疣孢漆斑菌。该菌株在液体发酵培养基中产漆酶活性与菌丝生长和胞外蛋白总量基本同步,发酵第6天达到酶活峰值9.28 U·m L-1。疣孢漆斑菌NF-08产酶最佳碳、氮源分别为4.0%葡萄糖和3.5%蛋白胨,培养基初始p H7.0。最适装液量60 m L·(250 m L)-1,最适接种量4%,最适培养温度和摇床转速分别为30℃和140 r·min-1。没食子酸、阿魏酸和单宁酸显著诱导疣孢漆斑菌NF-08漆酶活性的产生,以没食子酸效果最好。经过培养基组分和培养条件优化以及底物诱导,疣孢漆斑菌NF-08产酶水平达到16.82 U·m L-1,比优化前提高了81.25%。【结论】建立环境样品中产漆酶真菌的分离、纯化及筛选方法,获得了一株发酵周期短、产漆酶活力高的半知真菌疣孢漆斑菌NF-0
- 高冬妮范晓旭赵丹
- 关键词：半知菌漆酶产酶条件
- 不同启动子对HA-VP2重组杆状病毒蛋白表达的影响
- 2017年
- 为比较不同启动子对传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白表达的影响,择优表达体系。本研究将添加了表位附加标记HA-TAG的IBDV-VP2基因整合至含有CMV、CBA和EF1α启动子的重组转移载体中,构建HA-VP2重组杆状病毒,并通过侵染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)分析蛋白表达水平,以确定最优启动子。用Gel-Pro analyzer 4.5软件分析Western blotting条带。结果表明,含有CMV、CBA及EF1α启动子的重组杆状病毒所表达的HA-VP2蛋白强度分别为270.61、290.26及83.45,且各启动子活性差异显著(P<0.05),其中CMV与CBA启动子的活性相近能够较高效率地表达HA-VP2蛋白,但EF1α启动子活性较以上2种启动子活性较低。本研究通过比较分析不同启动子对蛋白表达水平的影响,以此择优表达体系,为禽类基因工程疫苗的发展提供新思路。
- 于航高冬妮田兆峰平文祥葛菁萍
- 关键词：VP2杆状病毒表达系统
- 副干酪乳杆菌HD1.7prcR基因siRNA
- 副干酪乳杆菌HD1.7prcR基因siRNA，它涉及副干酪乳杆菌基因的siRNA分子。它解决构建自杀质粒难度大，同源臂的长短依赖目的基因的长短，不利于同源重组的发生等问题。siRNA‑R1核苷酸序列为5'‑AUACCCA...
- 葛菁萍孙艳阳王洋高冬妮平文祥
- 文献传递
- 一种可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌
- 一种可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌，它涉及一种地衣芽孢杆菌。解决了现在利用真菌产生β-甘露聚糖酶存在酶活低的问题。可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌属于地衣芽孢杆菌新种，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市...
- 葛菁萍平文祥宋刚凌宏志赵丹高冬妮
- 文献传递
- 鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆及序列分析被引量：1
- 2012年
- 用SPF鸡胚成纤维细胞繁殖鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)J1C7毒株。用纯化的病毒颗粒提取RNA基因组。根据已报道的IBDV JD1株的VP2序列设计引物,利用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)进行扩增,将获得的1 359 bp片段克隆于pMD 18-T载体上。经过限制性酶切及PCR鉴定后,得到阳性重组质粒。对VP2基因进行全序列测定表明,克隆的VP2基因长1 359 bp,编码452个氨基酸。J1C7株VP2蛋白高变区内两个亲水区与其他标准Ⅰ型毒株完全相同,而且具有弱毒疫苗株的特征性氨基酸:222P、256V、279N、284T、294L、299N,七肽区的氨基酸序列为SWS ARGS,因此,从分子水平上推断本研究的J1C7株为标准Ⅰ型毒株,且属于弱毒疫苗株。与已报道的IBDV VP2基因的氨基酸序列进行比对,结果表明,本研究的J1C7株与来自欧洲和中国的弱毒疫苗株有密切的亲缘关系。
- 唐晓艳宋姗姗高冬妮楼庄伟平文祥葛菁萍
- 关键词：传染性法氏囊病病毒VP2克隆
- 一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法
- 一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，它涉及一种质粒载体的构建方法。它解决了目前酿酒酵母缺乏木糖醇脱氢酶(XDH)，而不能使木糖代谢后产生乙醇问题。构建方法：一、克隆xyl2基因；二、回收、纯化xyl2基因片段后与p...
- 平文祥葛菁萍杜春梅凌宏志宋刚赵丹高冬妮洛雪
- 文献传递
- 鸡IL-2重组杆状病毒的构建及其病理组织学研究
- 2017年
- 以鸡白细胞介素2(IL-2)为免疫刺激因子,探讨鸡IL-2重组杆状病毒(BV-LMI-IL-2)对鸡脏器的影响,为IL-2促进疫苗免疫的研究提供理论依据。以IL-2为目的基因,以p LMI为杆状病毒转移载体,构建BV-LMI-IL-2。最终使用BV-LMI-IL-2与新城疫(NDV)抗原疫苗BV-LMI-F进行单独免疫和联合免疫,观察鸡腺胃、肝脏、心脏、十二指肠等器官病理变化情况。免疫和攻毒试验结果显示:BV-LMI-F与BV-LMI-IL-2联合免疫时,保护率提高了12.5%,说明BV-LMI-IL-2对疫苗起到了免疫增强作用,可以作为免疫增强剂使用。对攻毒后的对照组死亡鸡只和免疫组死亡的鸡只剖检,观察病变器官和病理组织切片结果显示,联合免疫组器官无明显病理变化,证明鸡IL-2重组杆状病毒提高了对鸡脏器器官的免疫保护作用。
- 葛菁萍白程乐高冬妮申艳于航平文祥
- 关键词：白细胞介素2重组杆状病毒联合免疫器官病理组织学
