刘铁连
- 作品数：22 被引量：57H指数：5
- 供职机构：苏州大学医学部更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国防科技工业技术基础科研项目江苏省高校自然科学研究项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 表达人IL-17F重组腺病毒载体的构建及其表达产物的功能研究被引量：3
- 2013年
- 目的构建表达人白细胞介素IL-17F （hIL-17F）的重组腺病毒载体（Ad-hIL-17F），为进行hIL-17F基因表达抑制血管形成和抑瘤效应的研究奠定基础。方法以pUCm-T/hIL-17F重组质粒为模板PCR扩增hIL-17F，酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack-CMV转移质粒上，PmeⅠ线性化重组质粒pAdTrack-CMV-hIL-17F，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌，经同源重组，获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pTrack-CMV-hIL-17F经PacⅠ线性化后转染QBI-293A细胞，收获Ad-hIL-17F，用RT-PCR和间接免疫荧光法鉴定人IL-17F基因表达。 MTT法检测hIL-17F基因表达对ECV304细胞的生长抑制作用， ELISA法检测人血管内皮生长因子（ VEGF）和血管生成素（ Ang-1）基因在293A细胞、ECV304细胞中的表达水平；实时定量RT-PCR检测Ad-hIL-17F对293A细胞中人VEGF转录的影响。结果测序显示hIL-17F序列正确，RT-PCR和间接免疫荧光法检测到了IL-17 F基因的表达。 Ad-hIL-17 F能显著抑制ECV304细胞的生长，抑制人VEGF和Ang-1基因在293 A细胞、ECV304细胞中的表达。结论成功构建和获得了hIL-17F的重组腺病毒载体（Ad-hIL-17F）， Ad-hIL-17 F可通过下调VEGF和Ang-1的分泌而抑制血管形成。
- 盛伟华任苏勤谢宇锋缪竞诚刘铁连杨吉成
- 关键词：腺病毒载体
- Ad-Ang-1转基因成纤维细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成效应及其分子机制研究
- 2011年
- 目的研究经腺病毒介导的人血管生成素-1（Ad-Ang-1）转基因细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成活性及其分子机制。方法将Ad-Ang-1腺病毒病毒子感染再生丝素膜上培养的wI-38人胚肺成纤维细胞，通过ELISA法检测再生丝素膜对成纤维细胞目的基因表达的影响，将Ad—Ang-1转基因WI-38细胞修饰的丝素材料进行鸡胚尿囊膜血管形成实验（CAM）和兔角膜层间植入诱导角膜新生血管试验，并用ELISA法检测其对血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）、血小板衍化生长因子（PDGF）表达的影响。结果Ad—Ang-1可感染再生丝素膜上培养的成纤维细胞，ELISA法检测结果表明sF组Ad．Ang．1转基因W1．38细胞可以成功表达目的基因（P〈0．05）。CAM实验表明Ad-Ang-l转基因wI-38细胞修饰的再生丝素膜具有促进CAM血管生成的活性，并通过兔角膜层间植入实验进一步证明Ad-Ang-1转基因细胞修饰的丝素材料具有诱导角膜组织血管生成的作用．其机制可能与再生丝素膜对Ad-Ang-l转基因的WI-38成纤维细胞中不仅可以成功表达目的Ang-1，而且还可使与血管生成和组织损伤修复相关的VEGF、FGF2、PDGF基因表达水平明显提高有关。结论Ad-Ang-I转基因细胞修饰的丝素材料具有诱导血管生成的作用，为今后进一步采用转基因技术对生物材料进行修饰或改性、研制出具诱导性的医用生物膜材料创造了条件。
- 钱丽娟刘铁连张晓峰谢宇锋盛伟华缪竞诚韩亚丽杨吉成
- 关键词：血管生成素腺病毒
- Ang-1和VEGF165腺病毒的载体构建及其表达
- 目的:构建人血管生成素-1(Ang-1)和人血管内皮生长因子VEGF165(VEGF165)的腺病毒载体,为下一步用Ang-1和VEGF165转基因细胞修饰丝素材料进行动物创伤恢复实验研究奠定基础。
方法:通过...
- 刘铁连谢宇锋盛伟华缪竞成单云波胡志清井莹莹杨吉成
- 关键词：血管生成素-1腺病毒载体RT-PCR法血管形成
- 文献传递
- 再生丝素膜对转基因角膜上皮细胞表达细胞因子的影响
- 2009年
- 目的探讨再生丝素膜对转基因人角膜上皮细胞表达细胞因子的影响，以及转基因细胞修饰的再生丝索膜构建生物材料复合体的可能性。方法实验研究。兔角膜缘注射重组腺病毒载体血管内皮生长因子165（Ad-VEGF165）诱导新生血管，测量角膜新生血管生长面积，分析角膜组织血管内皮细胞生长因子免疫组织化学结果。用再生丝素膜培养角膜上皮细胞，观察细胞形态、生长曲线、Ad—VEGF165感染效率。收集再生丝素膜Ad—VEGF165转基因角膜上皮细胞培养上清，酶联免疫吸附试验法检测上清中血管内皮生长因子、血管生成素1、表皮生长因子、转化生长因子等细胞因子浓度。采用双因素方差分析基因感染和再生丝素膜材料两因素对HCECs细胞因子表达水平的比较。结果（1）角膜缘注射Ad-VEGF165后第1周、第1个月角膜新生血管面积分别为（7．60±1．12）mm^2、（12．28±2．54）mm^2，注射后第3天、第1周、第1个月角膜基质内可见血管内皮生长因子阳性表达。（2）再生丝素膜及无再生丝素膜两种培养条件，角膜上皮细胞细胞形态、生长曲线、Ad-VEGF165感染效率均无明显差异。（3）再生丝素膜培养Ad-VEGF165转基因角膜上皮细胞上清中各细胞因子浓度分别为血管内皮生长因子（721．67±66．97）ng／L、表皮生长因子（1042．67±315．81）ng／L、血管生成素1（2421．00±0．00）ng／L、转化生长因子（313．33±34．06）ng／L。无再生丝素膜Ad-VEGF165转基因角膜上皮细胞培养上清各细胞因子浓度分别为血管内皮生长因子（721．67±66．97）ng／L、表皮生长因子（860．33±315．81）ng／L、血管生成素1（1960．33±797．90）ng／L、转化生长因子（278．00±53．11）ng／L。Ad—VEGF165感染角膜上皮细胞培养上清中各细胞因子浓度均显著高于对照组，分别为血管内皮生长因子（F=168．16，P〈0．0001）、
- 张晓峰刘铁连盛伟华杨吉成缪竞成
- 关键词：丝素蛋白上皮角膜腺病毒科血管内皮生长因子A
- 腺病毒介导的ING4对裸鼠人骨肉瘤移植瘤的生长抑制作用被引量：2
- 2009年
- 目的:研究腺病毒介导的人ING4基因(Ad-ING4)对MG-63人骨肉瘤细胞移植瘤的生长抑制作用及其机制。方法:将本室构建好的重组腺病毒表达载体Ad-ING4,经QBI-293A细胞感染多轮扩增后获得高效价重组病毒子以用于肿瘤基因治疗试验,首先建立MG-63人骨肉瘤细胞移植瘤裸鼠模型,然后将15只荷瘤裸鼠随机分为阴性对照组(PBS组)、空载体对照组(Ad-GFP组)、Ad-ING4实验组(Ad-ING4组),3组均使用瘤体内注射干预用药,隔日一次,共5次。分别于用药前和用药后测量皮下瘤的体积,治疗开始后的第15天将裸鼠脱颈处死,摘取瘤体称重,计算抑瘤率。HE染色观察移植瘤细胞形态,免疫组化法检测瘤体中Bcl-2、Bax、Caspase-3、VEGF、CD34细胞因子的表达。结果:获得了高滴度(109pfu/ml)的重组腺病毒Ad-ING4;经瘤体基因治疗后,Ad-ING4组与PBS组及Ad-GFP组相比,可以明显抑制裸鼠MG-63人骨肉瘤细胞移植瘤生长,瘤重抑制率可达59.3%,移植瘤组织中可出现典型的细胞凋亡、坏死现象,其分子机制可能与Ad-ING4明显上调瘤体中促进凋亡的细胞因子Bax、Caspase-3的表达,下调抑制凋亡因子Bcl-2及血管形成细胞因子VEGF、CD34的表达有关。结论:Ad-ING4可以显著抑制MG-63人骨肉瘤细胞荷瘤生长,其机制可能通过激活细胞凋亡和抑制血管形成等途径来发挥抑瘤作用。
- 韩亚丽缪竞诚盛伟华井莹莹单云波刘铁连李正祎包婉蓉杨吉成
- 关键词：ING4腺病毒抑瘤
- Ad-ING4-poly（A）-Promoter-IL-24双基因共表达载体构建及表达
- 2010年
- 目的 构建poly（A）-Promoter介导的携带人肿瘤生长抑制因子4（ING4）和人白细胞介素-24（IL-24）双基因的重组腺病毒共表达载体Ad-ING4-poly（A）-Promoter-IL-24（简称Ad-ING4-IL-24）,研究Ad-ING4-IL-24对HepG-2人肝癌细胞生长的影响.方法 以含有poly（A）和Promoter （hEF1-eIF4g）基因片段的pORF-mbcl-2α质粒为模板,PCR扩增poly（A）-Promoter目的 片段（含Sal Ⅰ,Not Ⅰ）,亚克隆至pAdTrack-CMV载体中以构建pAdTrack-CMV-poly（A）-Promoter空载体,再分别以pcDNA3.0-ING4和pcDNA3.0-IL-24重组质粒为模板,PCR扩增ING4（含BglⅡ,Sal Ⅰ）和IL-24（含XhoⅠ,XbaⅠ）目的 基因片段,并依次插入pAdTrack-CMV-poly（A）-Promoter载体中构建pAdTrackCMV-ING4-Poly（A）-Promoter-IL-24双基因共表达重组转移载体,测序正确后用Pme Ⅰ酶线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1构建同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-poly（A）-Promoter-IL-24,再经Pac Ⅰ酶线性化后用脂质体转染QBI-293A包装细胞,经多轮扩增后收获Ad-ING4-IL-24重组腺病毒子,其效价可达3.5×109PFU/ml,用RT-PCR和Western blot法分别鉴定ING,4和IL-24基因在HepG-2人肝癌细胞中的转录和表达,MTT法和流式细胞仪检测Ad-ING4-IL-24对HepG-2人肝癌细胞生长抑制和诱导细胞凋亡的功能及其增效作用.结果 DNA测序结果显示pAdTrack-CMV转移载体中插入的ING4、poly（A）-Promoter和IL-24序列与GenBank报道的完全一致,RT-PCR和Western blot检测结果显示Ad-ING4-IL-24能成功介导ING4和IL-24基因在HepG-2人肝癌细胞中表达 并能明显抑制HepG-2人肝癌细胞的生长和诱导其凋亡,其中Ad-ING4-IL-24双基因组更优于相应各单基因组.结论 成功构建了poly（A）-Promoter介导的Ad-ING4-IL-24双基因共表达重组腺病毒载体,Ad-ING4-IL-24不仅能明显抑制HepG-2人肝癌细胞生长和诱导其凋亡,而且与Ad-ING4和AdIL-24单基因组相比具有抑癌增效作用.
- 盛伟华谢宇锋缪竞诚顾范博单云波刘铁连井莹莹胡志清杨吉成
- 关键词：生长抑制因子4IL-24肿瘤基因治疗
- Ad-IL-24对MG-63人骨肉瘤细胞抑癌效应的体内外实验被引量：3
- 2009年
- 本研究旨在分析腺病毒携带的IL-24基因在体内外对人骨肉瘤细胞生长抑制效应及其分子机制。将Ad-IL-24重组腺病毒感染MG-63细胞,用荧光显微镜、RT-PCR法检测IL-24在MG-63细胞中的转录和表达;MTT法、流式细胞技术和Hoechst染色法检测IL-24基因的表达对MG-63细胞的生长抑制和凋亡效应;半定量RT-PCR法检测IL-24基因的表达对MG-63细胞中的bcl-2、bax、caspase-3相关基因表达的影响。用Ad-IL-24重组腺病毒在MG-63骨肉瘤荷瘤裸鼠的瘤体内进行注射治疗,观察肿瘤生长变化,15d后处死裸鼠,摘除瘤体,称瘤重。并通过免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3等与细胞凋亡相关因子的表达。结果表明Ad-IL-24重组腺病毒感染MG-63细胞后,能明显抑制MG-63细胞增殖,并能通过上调细胞中bax、caspase-3和下调bcl-2基因表达,诱导细胞凋亡,呈现出典型细胞凋亡形态学变化。Ad-IL-24重组腺病毒瘤内注射MG-63裸鼠荷瘤骨肉瘤移植瘤后,能显著抑制肿瘤生长,瘤重的抑制率可达52%,免疫组化结果显示Ad-IL-24重组腺病毒能明显上调与细胞凋亡相关因子Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2和CD34的表达。本研究结果显示腺病毒介导的IL-24基因在体内外均可明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞的生长,诱导其凋亡,其机制可能与下调bcl-2,上调bax、caspase-3的基因表达水平有关,由此为骨肉瘤的基因治疗提供实验依据。
- 韩亚丽缪竞诚盛伟华汪小华井莹莹单云波刘铁连包婉蓉杨吉成
- 关键词：IL-24基因腺病毒载体肿瘤抑制
- Ad-VEGF165转基因成纤维细胞修饰的再生丝素膜诱导血管形成效应及其分子机制研究
- 2011年
- 目的研究经腺病毒介导的人血管内皮生长因子165(VEGF165)转基因细胞修饰的再生丝素膜(SF)诱导血管形成活性及其分子机制。方法将WI-38人胚肺成纤维细胞分别培养在有(SFC组)或无(PBS组)再生丝素膜的24孔培养板上,24h后用带绿色荧光蛋白(GFP)基因的空载体腺病毒Ad-GFP(Ad-GFP组/SFCG组)或含有VEGF165目的基因的重组腺病毒Ad-VEGF165(Ad-VEGF165组/SFCV组)感染培养细胞。通过形态学观察和ELISA法检测各组细胞培养上清液中VEGF165目的基因表达及其对细胞自分泌的血管生成素-1(Ang-1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)、血小板衍化生长因子(PDGF)表达的影响,并用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)和在兔眼角膜上进行新生血管诱导实验。结果形态学观察发现WI-38细胞在再生丝素膜上不仅贴壁生长良好,而且易被Ad-GFP、Ad-VEGF165腺病毒感染,呈现强荧光。再生丝素膜利于Ad-VEGF165组中VEGF165目的基因在细胞中的高表达(P<0.05),而且还可使细胞自分泌的Ang-1表达水平明显升高(P<0.05),同时可维持细胞自分泌的FGF2及PDGF稳定表达。Ad-VEGF165组(SFCV组)具有促进CAM上血管生长活性和诱导兔眼角膜组织新生血管生成作用。结论 Ad-VEGF165感染WI-38成纤维细胞所修饰的再生丝素膜,具有诱导血管新生的功能。
- 钱丽娟刘铁连张晓峰谢宇锋盛伟华缪竞成韩亚丽杨吉成
- 关键词：血管内皮生长因子腺病毒转基因
- 重组载体以及转基因骨髓基质细胞修饰的丝素膜及其应用
- 本发明涉及生物领域，具体公开了重组了VEGF165与Ang-1的pAdTrack-CMV-VEGF165-PolyA-promoter-Ang-质粒和pAdTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1质粒，其...
- 杨吉成缪竞诚盛伟华韩亚丽刘铁连张晓峰
- 文献传递
- 腺病毒载体介导的ING4基因对MG-63人骨肉瘤细胞的抑制作用被引量：9
- 2009年
- 目的:用人源化改造的鼠肿瘤生长抑制因子(mING4)基因构建的腺病毒表达载体(Ad-ING4)研究对MG-63人骨肉瘤细胞的抑制作用。方法:以pcDNA3.0-mING-4重组质粒为模板,通过基因定点突变技术对mING4基因进行人源化改造,采用腺病毒载体的基因重组和体外包装技术获得表达与人ING-4氨基酸序列相同的重组腺病毒子(Ad-ING4),感染MG-63细胞,用荧光显微镜、RT-PCR法检测ING4在MG-63细胞中的转录和表达;MTT法和流式细胞技术检测ING4基因表达对MG-63细胞的生长抑制和凋亡效应;荧光共聚焦显微镜观察MG-63细胞凋亡的形态学变化;半定量RT-PCR法检测ING4基因表达对MG-63细胞中的Bax、Bcl-2基因表达的影响。结果:基因测序和PCR分析结果显示,人源化改造的小鼠ING4分子氨基酸序列与人ING4分子完全相同,成功构建了Ad-ING4腺病毒表达载体,在MG-63细胞中ING4基因的表达对MG-63细胞增殖有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡,出现典型细胞凋亡形态学变化,ING4基因表达可通过上调细胞中Bax和下调Bcl-2基因表达诱导细胞凋亡。结论:转染ING4基因可明显抑制MG-63人骨肉瘤细胞的生长,诱导细胞凋亡,该现象可能是通过改变Bax,Bcl-2表达水平来发挥抗肿瘤作用的。
- 井莹莹杨吉成缪竞诚盛伟华胡志清单云波刘铁连韩亚丽包婉蓉
- 关键词：ING4基因腺病毒载体凋亡
