李永海
- 作品数：7 被引量：11H指数：2
- 供职机构：首都师范大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市科技新星计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 重组大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶体外分子交联的初步研究
- 本文为了证实或完善和补充蛋白质分子交联的三步假说，以原核生物的蛋白NADP特异性谷氨酸脱氢酶(NADP-GDH)和鸡溶菌酶作为实验材料，采用PCR方法从大肠杆菌DH5a菌株中克隆得到NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因，构建重...
- 李永海
- 关键词：蛋白质二硫键异构酶谷氨酸脱氢酶热变性
- 文献传递
- 大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基的克隆、表达、纯化及包涵体的复性被引量：2
- 2005年
- 利用PCR技术从大肠杆菌BL21中获取酒石酸脱氢酶β亚基基因(TtdB),并将之克隆到质粒pUC18上,转化大肠杆菌DH5α细胞.经测序证明序列无误后,将之与表达载体pTrcHisC连接,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和双波长扫描分析,确定酒石酸脱氢酶β亚基在大肠杆菌中表达时以包涵体形式存在.目的蛋白用TALON金属亲和树脂纯化,通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性.复性产率可达90%.
- 徐燕李永海刘凤华席慧周霞高音
- 关键词：基因克隆包涵体复性
- 原核生物核糖核酸酶HII基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达被引量：1
- 2004年
- 核糖核酸酶HII (RNaseHII)能有效降解RNA和DNA杂交链中的RNA链。为进一步研究其功能 ,利用大肠杆菌XL1blue为模板 ,相应的寡聚脱氧核苷酸为引物 ,PCR扩增大肠杆菌RNaseHII(rnh 2 )基因 ,并将目的基因连接到克隆载体 pUC18上 ,经测序确认无误 ,分别亚克隆到能够进行IPTG诱导的表达载体pTrcHisC和进行温度诱导的表达载体pBV2 2 0上。重组质粒转化到大肠杆菌DH5α细胞中获得高效表达。在载体pTrcHisC和 pBV2 2 0中目的蛋白RNaseHII的表达量均超过菌体总蛋白的 2 0 % ,且表达产物以稳定的包涵体形式存在。此项工作为以后目的蛋白的纯化提供了有利条件 ,并为研究其结构和功能奠定了基础。
- 席慧刘凤华周霞徐燕李永海高音
- 关键词：原核生物基因克隆大肠杆菌包涵体
- 突变型大肠杆菌二氢叶酸还原酶基因的合成被引量：3
- 2005年
- 利用PCR定点突变技术 ,以野生型大肠杆菌二氢叶酸还原酶基因为模板 ,获取 3种突变型 (Cys85Ser,Cys15 1Ser,Cys85 15 1Ser)二氢叶酸还原酶 (DHFR)基因 .用限制性内切酶BamHⅠ与PstⅠ将 3种突变基因片段插入到克隆载体pUC18上 ,进行蓝白筛选 ,将筛选的克隆进行DNA序列测定 .
- 刘凤华席慧周霞李永海徐燕高音
- 关键词：突变型二氢叶酸还原酶酶基因大肠杆菌DHFR定点突变技术
- 大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化被引量：3
- 2005年
- 谷氨酸脱氢酶是生物体内最主要的氧化脱氨基酶类 ,为了进一步研究其功能 ,我们以大肠杆菌DH5α菌株基因组DNA为模板和相应的寡聚脱氧核苷酸为引物 ,进行PCR扩增大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因 (NADP specificglutamatedehydrogenase ,gdhAgene) ,将所得DNA片断连接到质粒pUC18上 ,转化大肠杆菌DH5α ,进行蓝白筛选和酶切鉴定 ,经测序证明序列正确无误后将gdhA基因连接到表达载体pTrcHisC上 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达 ,经SDS PAGE和双波长扫描分析 ,确定大肠杆菌谷氨酸脱氢酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在 ,未能检测到可溶性蛋白的表达 ,表达量可达菌体总蛋白的 15 %以上 .
- 李永海徐燕席慧刘凤华周霞高音
- 关键词：谷氨酸脱氢酶大肠杆菌DH5Α特异性DNA片断
- 鸡溶菌酶和重组大肠杆菌融合蛋白(NADP-GDH)体外分子交联的初步研究被引量：1
- 2004年
- 用PCR方法克隆的大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶 (NADP specificglutamatedehydrogenase ,NADP GDH)基因和其突变基因 ,插入表达载体pTrcHisC构建重组蛋白质表达体系 .经过IPTG诱导表达 ,用Talon固定化金属亲和层析树脂纯化出重组的天然和突变NADP GDH ,将它们和溶菌酶 (Lysozyme)通过热诱导去折叠方法进行体外蛋白质分子交联实验 ,在去折叠反应液中加入还原剂二硫苏糖醇 (DTT)后 ,不但没有分子间二硫键交联形成 ,同时也没有其他分子间共价键 (异肽键 )交联的形成 .另外 ,半胱氨酸残基定点突变后的NADP GDH重组蛋白质 ,无法参与形成分子间二硫键 ,实验证实经过热诱导去折叠后也没有分子间共价键 (异肽键 )交联 .这些结果进一步证明蛋白质分子间二硫键的形成能够促进蛋白质其他分子间共价键 (异肽键 )的形成 .
- 李永海徐燕席慧刘凤华周霞高音
- 关键词：二硫键
- 大肠杆菌硫氧还蛋白thioredoxin基因的克隆及表达被引量：1
- 2004年
- 以大肠杆菌XL1blue为模板 ,通过PCR技术扩增大肠杆菌硫氧还蛋白基因 ,并将目的基因分别连接到克隆载体pUC18和表达载体pTrcHisC上 ,构建重组质粒 .重组质粒pTrcHisC TRX在大肠杆菌中高效表达 ,最后利用固定化金属螯合亲和层析技术 (IMAC)获得较纯的目的蛋白 .为进一步研究硫氧还蛋白的功能及其应用提供了条件 .
- 席慧刘凤华李永海徐燕高音
- 关键词：硫氧还蛋白UC重组质粒目的基因固定化
