韩志强
- 作品数：15 被引量：18H指数：2
- 供职机构：郑州大学第一附属医院更多>>
- 发文基金：河南省教育厅自然科学基金河南省基础与前沿技术研究计划项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 构建hTERT真核表达载体并转染人骨髓间充质干细胞被引量：1
- 2007年
- 目的构建含人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的真核表达质粒并转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）。方法①目的基因的获得：用RT-PCR法从人食管癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段;②将hTERT基因片段插入pcDNA3.1后转化到大肠杆菌DH5α,阳性克隆酶切鉴定后测序分析;③大量提取质粒,非脂质体法转染hM-SC,并用G418筛选出阳性克隆。结果与结论pcDNA3.1/hTERT重组质粒构建成功,并能在hMSC中整合。
- 岳学静宋波许予明赵国强韩志强
- 关键词：人端粒酶逆转录酶真核表达载体重组质粒
- TAT-SOD融合蛋白表达载体的构建被引量：1
- 2010年
- 目的:构建pET28a-TAT-SOD原核表达载体,纯化并测定其活性。方法:PCR法扩增TAT-SOD片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT-SOD重组表达子,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导TAT-SOD融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白,利用SOD活性测定试剂盒测定其活性。结果:构建了高表达重组子pET28a-TAT-SOD,获得了相对分子质量约为25000的具有活性的融合蛋白TAT-SOD,纯度达90%。纯化的蛋白浓度为700mg/L,活性为197.54U/L。结论:成功构建了具有活性TAT-SOD融合蛋白的表达载体。
- 王茜茜宋波苗成韩志强许予明
- 关键词：TATSOD蛋白转导
- 重组慢病毒载体pLKO-1-EGFP-puro的构建被引量：2
- 2010年
- 目的:构建具有绿色荧光蛋白(GFP)标记及嘌呤霉素(puro)抗性的重组慢病毒载体。方法:改建慢病毒载体质粒pLKO-1-puro的多克隆位点(MCS),以质粒pEGFP-C3为模板扩增出CMV-EGFP并与pLKO-1-puro连接,形成重组的慢病毒载体质粒pLKO-1-EGFP-puro,后者与包装质粒Δ8.2和包膜蛋白质粒VSV-G在293T细胞中进行包装,产生重组慢病毒颗粒,感染非洲绿猴肾细胞Vero细胞,观察GFP的表达。结果:成功改建了慢病毒载体质粒pLKO-1-puro并插入了CMV-EGFP,形成了新型慢病毒载体质粒pLKO-1-EGFP-puro。3质粒共转染293T细胞产生的重组慢病毒颗粒感染Vero细胞后高表达绿色荧光。结论:成功构建了高效的带GFP报告基因及嘌呤霉素抗性的慢病毒载体。
- 宋波韩志强吴少璞刘景伟蔡晓辉杨靖许予明
- 关键词：神经系统遗传病慢病毒载体绿色荧光蛋白
- 携带GFP绿色荧光标记的重组BAC-HSV-1 HF株的构建及其子代病毒的特性研究被引量：1
- 2011年
- 本研究旨在构建由细菌人工染色体(Bacteria artificial chromosome,BAC)携带的单纯疱疹I型病毒质粒及携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的重组型BAC-HSV-1感染性子代病毒。构建了携带HSV-1同源臂的质粒C223-UL43左臂-UL47右臂。将该质粒线性化后与HSV-1基因组共转染至Vero细胞,通过真核细胞内同源重组产生了含有GFP报告基因的BAC-HSV-1重组病毒,噬斑纯化筛选出阳性重组病毒,并再次感染Vero细胞,Hirt法提取BAC-HSV-1环形基因组并将其电穿孔入DH10B感受态细胞,由PCR和酶切法鉴定BAC-HSV-1质粒。为研究BAC-HSV-1子代病毒的生物学特性,将实验组和对照组细胞分别给予BAC-HSV-1质粒和HSV-1基因组DNA,收取病变细胞的上清液,以MOI=0.1再次感染Vero细胞,半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infective dose,TCID50)法测定两组的病毒滴度。PCR和酶切法分别鉴定BAC-HSV-1,结果示BAC-HSV-1构建成功。TCID50法测定实验组和对照组病毒滴度,经统计学分析两组病毒滴度间差异无统计学意义(P>0.05)。本研究成功地构建了真核细胞和原核细胞间穿梭的HSV-1-BAC重组病毒/质粒。
- 刘新静宋波卢甲盟王青志韩志强许予明
- 关键词：细菌人工染色体单纯疱疹病毒I型
- 重组Mash1慢病毒表达载体的构建
- 2006年
- 目的:克隆小鼠Mash1基因的全长cDNA,构建其慢病毒表达载体Lentivirus-Mash1,为进一步研究Mash1在神经发育及干细胞神经分化中的作用奠定基础。方法:应用RT-PCR从小鼠13d胚胎中扩增出Mash1cDNA片段,经回收纯化与pGEM-T载体连接并转化感受态细菌J M109,通过蓝白筛选、PCR扩增和双酶切鉴定出阳性菌落,并对其进行基因测序。BamHⅠ和XholⅠ双酶切pGEM-T-Mash1和Lentivirus获得的目的基因双粘片段与Lentivirus双粘线性质粒相连接,转化J M109,酶切方法鉴定重组阳性菌落。结果:PCR扩增、酶切分析及序列测定证实成功获取Mash1cDNA克隆;酶切鉴定证实Lentivirus-Mash1含有大小正确的正向Mash1cDNA片段。结论:成功建立了小鼠Mash1cDNA克隆并构建了慢病毒表达载体Lentivirus-Mash1。
- 张瑞许予明赵国强郭建新宋波张世杰韩志强
- 关键词：慢病毒表达载体RT-PCR基因
- 靶向ICP4的小干扰RNA对HSV-1病毒复制能力的影响被引量：1
- 2010年
- HSV-1是一种嗜神经病毒,能引起一系列神经系统严重症状,然而目前抗HSV-1药物易反弹、不能完全清除潜伏的病毒。ICP4对HSV复制、转录起主要调节作用,决定着溶细胞型感染或潜伏状态的平衡点。为了探寻新的抗病毒策略,本课题以HSV-1ICP4基因为靶点,设计合成2对siRNA,并构建重组真核慢病毒表达质粒pL-KO-puror-hU6-siRNA,通过脂质体转染和嘌呤霉素筛选建立靶向ICP4的4个siRNA单克隆细胞系,Real-timePCR法检测细胞系中ICP4的mRNA表达水平,TCID50法检测siRNA对HSV-1病毒复制能力的影响。结果显示靶向siRNA能有效抑制单克隆细胞系中的ICP4表达,并且抑制ICP4的表达后HSV-1病毒复制能力明显减弱,表明靶向ICP4的siRNA对HSV-1复制有明显抑制作用,且多位点siRNA联合干扰对病毒复制有协同抑制效果,有望应用于生物抗病毒药物的制备。
- 刘玉涛宋波王亚仑许予明韩志强赵莘瑜贾丽洁
- 关键词：RNA干扰抗病毒
- 人TAT-PDX-1融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
- 2011年
- 目的构建人TAT-PDX-1表达载体,并对其融合蛋白进行纯化。方法采用RT-PCR技术从人胰腺组织中获得目的基因hPDX-1,将TAT序列与PDX-1克隆到原核表达载体pET-28a;用IPTG诱导、表达融合蛋白;NiNTAagaros纯化融合蛋白,Western blot鉴定。结果目的片段PDX-1被有效扩增,DNA序列测定表明所构建重组质粒pET28a-TAT-h PDX-1与设计相同;TAT-PDX-1融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达并成功纯化。结论成功地获得了TAT-hPDX-1融合基因的表达产物,为进一步研究及临床应用奠定了基础。
- 苗成宋波王茜张宁韩志强许予明
- 关键词：原核表达蛋白转导域
- 慢病毒介导APP695基因RNAi对体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元β淀粉样蛋白分泌的影响被引量：3
- 2010年
- 目的 探讨慢病毒介导RNA干扰（RNAi）抑制APP695基因表达对体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元细胞分泌β淀粉样蛋白（Aβ）的影响.方法 构建靶向APP695基因的短发夹状RNA（shRNA）慢病毒表达质粒（pFU-GW-iRNA）,进行酶切和测序鉴定.慢病毒表达质粒与包装质粒（pHelper 1.0和Helper 2.0）共转染293T细胞,获得病毒浓缩液并测定滴度.使用APP695-shRNA慢病毒载体感染体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元,设定为慢病毒介导阳性干扰（APP695-RNAi）组,另设阴性对照病毒感染（NC）组、未经病毒感染（CON）组.采用实时荧光定量PCR检测APP695基因mRNA的表达,Western印迹检测APP695蛋白的表达,采用Elisa检测Aβ40和Aβ42的生成.结果 PCR扩增和测序结果证实,APP695 shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为5×108 TU/ml.使用慢病毒载体感染体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元,实时荧光定量PCR检测APP695-RNAi组APP695基因mRNA的抑制率为76.70%,与NC组和CON组相比差异有统计学意义（P＜0.001）.Western印迹结果显示蛋白水平表达下降与定量PCR一致.Elisa检测干扰72 h后APP695-RNAi组、NC组、CON组Aβ40的分泌分别为（184±15）ng/L、（647±30）ng/L、（656±40）ng/L.APP695-RNAi组与NC组和CON比较差异均有统计学意义（均为P＜0.001） APP695-RNAi组、NC组、CON组Aβ42的分泌分别为（19.2±1.9）ng/L、（67.6±6.0）ng/L、（68.6±7.0）ng/L.APP695-RNAi组与NC组和CON比较差异均有统计学意义（均为P＜0.001）.结论 慢病毒载体介导的APP695基因RNA干扰可以有效抑制痴呆小鼠皮质神经元细胞Aβ40和Aβ42的分泌.
- 赵莘瑜温丽君李国栋韩志强宋波许予明
- 关键词：基因慢病毒属
- 以人CCR5启动子为靶的药物筛选方法的初步建立被引量：5
- 2009年
- 构建靶向人趋化因子受体5(CCchemokine receptors5,CCR5)启动子的药物筛选系统。将CCR5启动子序列克隆入改建后的报告载体pGL3-neo,转染pGL3-neo-CCR5入Jurkat细胞(急性T淋巴细胞性白血病细胞),G418筛选后分组;用7种中药分别作用于各组细胞16h后,检测细胞中CCR5启动子的表达水平。结果显示,双黄连组比对照组的荧光值明显降低(P<0.05);川琥宁组、黄芩组、黄芪组比对照组的荧光值明显升高(P<0.01)。双黄连可使体外培养细胞转染的CCR5启动子活性降低,川琥宁、黄芩、黄芪可使体外培养细胞转染的CCR5启动子活性增高。表明初步构建成功靶向人CCR5启动子的药物筛选系统。
- 卫艳萍冯龙马云云董子明韩志强赵国强
- 关键词：体外筛选中药
- 上巩膜静脉电凝建立大鼠慢性高眼压模型被引量：1
- 2008年
- 目的建立大鼠稳定持久的慢性高眼压模型。方法健康成年W istar大鼠40只,术前眼压（15.13±1.48）mmHg,用高频电刀上的单极电凝器阻断右眼12-6点处的3条巩膜上静脉（左眼为对照眼）。结果术后1周,大鼠眼压升高为（25.72±3.54）mmHg,与术前相比,P〈0.01;术后4周眼压为（24.52±3.15）mmHg,仍高于左眼的（15.53±1.54）mmHg,二者相比,P〈0.01。结论上巩膜静脉电凝可建立稳定持久的大鼠慢性高眼压模型。
- 董敬民张金嵩胡军韩志强
- 关键词：青光眼高眼压
