余飞
- 作品数：15 被引量：55H指数：4
- 供职机构：扬州大学动物科学与技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 同源物种不同饲养层对鸡精原干细胞体外培养的影响被引量：2
- 2007年
- 分别以鸡胚来源的不同细胞为饲养层培养精原干细胞,比较3种不同的饲养层对精原干细胞体外培养的影响。结果显示:精原干细胞在鸡胚成纤维细胞饲养层和鸡睾丸支持细胞饲养层上存活时间较长、生长增殖状况良好。在鸡胚成纤维饲养层上传至四代,每代的AKP阳性克隆率分别为45%、40%、36%和21%。在以睾丸支持细胞为饲养层进行培养时传至三代,每代的AKP阳性克隆率分别是40%、32%、和22%。而以鸡肝细胞作为饲养层,精原干细胞未见有克隆形成,不能进行传代培养,表明鸡胚肝细胞饲养层不适合培养精原干细胞。
- 魏彩霞孙国波余飞李碧春
- 关键词：饲养层精原干细胞体外培养
- 体内外精原干细胞介导大群生产转基因鸡被引量：8
- 2008年
- 本研究以重组的绿色荧光蛋白基因为标记，采用公鸡睾丸内转染精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）和体外转染SSCs再移植的方法，探索家禽转基因新方法．同时比较了公鸡接受不同剂量外源基因的转基因效率．结果显示：（i）接受外源基因剂量分别为50，100，150和200μg／mL时，48h后睾丸细胞显示绿色荧光的比率分别为4．0％，8．7％，10．2％和13．6％，差异显著（P〈0．05）．睾丸内注射外源基因第25天后，随着时间的增长，精子表达绿色荧光的百分率逐渐提高，到第70天后表达率达到高峰，且趋于稳定，4个剂量组分别为12．7％，12．8％，15．9％和19．1％．差异显著（P〈0．05）；（ii）第70天的睾丸冰冻切片观察，曲精细管周边均有荧光表达；（iii）F1代中，56．2％（254／452）的胚盘表达绿色荧光．活鸡血样PCR检测56．5％（13／23）为阳性，Southern blot检测证明外源基因已整合到鸡基因组；F2代中，53．2％（275／517）的胚盘表达绿色荧光．活鸡血样PCR检测52．9％（9／17）为阳性；（iv）F，代和F2代鸡心、肝、肾和肌肉等组织冰冻切片观察和PCR检测，绿色荧光阳性率在50．0％～66．7％之间；（v）体外SSCs转染外源基因后移植，可在受体公鸡睾丸中生长发育，正常产生精子．后代中，12．5％（8／64）的胚盘表达绿色荧光，活鸡血样PCR检测11．1％（2／18）为阳性．结果证明精原干细胞介导转基因是一种简单、高效、可大群体生产转基因鸡的有效途径．
- 李碧春孙国波孙怀昌徐琪高波周冠月赵文明吴信生包文斌余飞陈国宏
- 关键词：绿色荧光蛋白基因
- 鸡胚胎干细胞单细胞克隆制备方法的比较
- 2008年
- 提取鸡X期胚盘细胞,体外培养传至第3代,采用口吸管法、细胞稀释法及克隆环法将细胞集落分离成单个细胞,并将其接种至96孔板上,每孔1个细胞,采用细胞化学法和免疫荧光法检测细胞表面标志物,探讨鸡胚胎干细胞单细胞克隆制备的实际操作的可行性,并对其生物学特性进行鉴定。结果表明:口吸管法、克隆环法、细胞稀释法克隆率分别为0、1.0%、4.2%。3种方法相比较,细胞稀释法具有操作简单易行、实验时间短、对细胞伤害小等优点,经碱性磷酸酶活性和阶段特异性表面抗原1免疫荧光鉴定均呈阳性,扩增出的克隆能稳定增殖且不分化。
- 何先红倪黎纲余飞李碧春
- 关键词：胚胎干细胞
- 红三叶愈伤组织培养与异黄酮的产生被引量：14
- 2006年
- 对红三叶Trifolium pratense下胚轴和子叶进行愈伤组织的培养,结果表明:添加2.0 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L 6-BA的MS培养基最适合诱导愈伤组织。采用紫外分光光度法对愈伤组织总异黄酮含量进行测定,结果发现:愈伤组织中异黄酮的含量明显高于实生苗,子叶愈伤组织中异黄酮的含量比下胚轴愈伤组织中的高,且差异显著(P<0.05)。
- 谷文英陈莹余飞
- 关键词：红三叶愈伤组织紫外分光光度法异黄酮
- 鸡精原干细胞定向诱导分化特性的研究被引量：3
- 2008年
- 取孵化18～20d的鸡胚睾丸，分离精原干细胞（SSCs），培养传代3次后，用特异性化学物质定向诱导分化，以研究鸡培养传代后SSCs保持多向分化的潜能。①用特异的化学物质地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C诱导鸡SSCs向成骨细胞分化，用Von Kossa＇s法、改良的钙钴法及免疫组化法进行成骨细胞鉴定；②用维甲酸（RA）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）诱导SSCs向神经元样细胞分化，甲苯胺蓝特异染色和组织化学鉴定。③用地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）诱导SSCs向脂肪细胞分化，特异性的油红O染色和脂肪细胞标志基因PPAR7检测。结果显示，SSCs被诱导15～21d后分化为成骨细胞，诱导形成率为80％；Von Kossa＇s染色细胞间布满黑色颗粒，具有矿化基质沉积；改良钙钴法碱性磷酸酶染色胞浆呈深棕色或深黑色，免疫组化染色细胞呈阳性。SSCs被诱导3～7d后分化为神经元样细胞，甲苯胺蓝染色阳性率为85％。SSCs被诱导7～21d后，分化成脂肪细胞，分化率为85％。诱导的脂肪细胞经特异性的油红O染色为阳性，并高表达脂肪细胞标志基因PPARγ。结论：在不同的诱导条件下，SSCs可被定向诱导分化为3种成体细胞，证明其培养传代后仍具有多向分化能力。
- 李碧春魏彩霞余飞何先红倪黎纲陈强王宵燕肖小君徐琪刘铁铮
- 关键词：精原干细胞成骨细胞神经元样细胞脂肪细胞分化
- 鸡抗病毒Mx蛋白修饰及其真核表达载体的构建被引量：8
- 2008年
- 利用高保真RT-PCR的方法从Poly(I).Poly(C)诱导的鸡成纤维细胞总RNA中扩增出鸡全长MxcD-NA,扩增产物克隆到pMD19-T Simple载体上,利用PCR突变技术将其第2 032位的碱基由G突变为A,经克隆测序证实突变成功后,将已突变的Mx基因插入真核表达载体,通过PCR、酶切鉴定插入片段正确,提取质粒转染COS-Ⅰ细胞进行RT-PCR鉴定。结果表明:正确克隆了鸡Mx基因,并成功对该基因进行PCR诱变修饰,构建了能够表达鸡Mx基因的重组真核表达载体,为Mx基因体内外表达及生物学活性的进一步研究奠定了基础。
- 倪黎纲何先红余飞李碧春高波谢飞程旭梅吴晓伟
- 关键词：MX蛋白真核表达载体
- 不同培养方法对鸡精原干细胞体外培养效果的影响被引量：1
- 2008年
- 本研究从孵化至16 d的鸡胚睾丸中分离获取精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs),比较3种培养液、2种处理(有无饲养层)对SSCs生长的影响,并对SSCs保持特性进行鉴定。结果表明:在无饲养层细胞存在的条件下,DMEM、TCM199和RPMI1640培养液中,SSCs的存活时间分别为6.5、6.0和3.5 d,DMEM和TCM199培养液之间差异不显著(P>0.05),但两者与RPMI1640之间均存在极显著差异(P<0.01)。在有饲养层细胞存在的条件下,在DMEM、TCM199和RPMI1640培养液中,SSCs的存活时间分别为45.5、38.0和14.0 d,三者相互之间存在着极显著的差异(P<0.01)。在6种培养体系中,SSCs在培养体系Ⅳ中的存活时间和AKP阳性克隆率分别为(45.5±3.20)d和0.31±0.46,极显著地高于其他5种培养体系(P<0.01)。SSCs在培养体系Ⅳ中传代至1、2和3代时,AKP阳性克隆率分别为31.6%、20%和18%。SSCs形成的克隆,经AKP活性检测和SSEA-1免疫染色,均呈阳性。传代至第3代的SSCs,其染色体组型保持不变,为2n=78。这些结果表明,SSCs在以DMEM为基础培养基的培养体系Ⅳ中培养至第3代时,仍保持干细胞未分化特性。
- 吴信生孙思宇吴洪魏彩霞孙国波余飞赵文明徐琪陈国宏李碧春
- 关键词：体外培养传代
- 鸡Mx基因全长cDNA序列的克隆及分析被引量：2
- 2007年
- 以Poly(I)-Poly(C)诱导鸡成纤维细胞Mx基因的表达,提取总RNA,RT-PCR扩增出全长Mx cDNA,扩增产物克隆入pMD19-T Simple载体中进行序列测定。结果表明:与GenBank公布的鸡Mx cDNA序列相比,其同源性达99.9%,为进一步研究鸡Mx基因的抗病毒活性和作用机理奠定了基础。
- 倪黎纲程金花谢飞陈昊何先红余飞李碧春
- 关键词：成纤维细胞
- 鸡胚胎原始生殖细胞转染EGFP基因的研究被引量：1
- 2007年
- 于鸡胚19期分离生殖嵴原始生殖细胞(PGCs),用于体外培养和传代扩增;对其第2代PGCs进行组织化学法鉴定,采用3种转染方法以增强型绿色荧光蛋白转染PGCs,并对电穿孔方法转染条件进行优化,荧光显微镜下计数细胞,分析PGCs转染效率,探讨有效的转染方法及其优化条件。结果表明:电穿孔方法可获得较高的转染效率,其最优化条件:电场强度为280 V,时间常数为60μs,质粒浓度为15μg.mL-1,转染后室温静置10 min。
- 孙鹏翔陈昊葛剑辉孙国波余飞陈国宏赵文明李碧春
- 关键词：鸡胚胎原始生殖细胞增强型绿色荧光蛋白转染
- 鸡精原干细胞分离培养的影响因素
- 2008年
- 目的:比较不同分离方法和培养体系对鸡精原干细胞(SSCs)生长的影响。方法:采用3种分离方法、6种培养体系对SSCs进行分离培养。结果:胶原酶+胰蛋白酶组合消化睾丸后获得的平均活细胞率显著地高于其余两种方法。在有和无饲养层细胞存在的条件下,SSCs在DMEM培养液中存活的时间分别为6.5 d和45.5 d,显著地长于在TCM199和RRMI1640中。在6种培养体系中,SSCs在有饲养层体系Ⅳ中存活时间和碱性磷酸酶(AKP)阳性克隆率分别为(45.5±3.2)d和31%±16%,显著地高于其他5种培养体系。SSCs在有饲养层体系Ⅳ中传代传至1、2和3代时,AKP阳性克隆率分别为31.6%、20%和18%。SSCs形成的克隆,经SSEA-1免疫染色,均为阳性。传代至第3代的SSCs,其染色体组型保持不变。结论:采用二酶组合法分离获取SSCs,而以DMEM为基础液形成的有饲养层体系Ⅳ较为适宜。
- 陈昊余飞赵文明吴信生徐琪李碧春
- 关键词：精原干细胞体外培养
