吕芬
- 作品数：5 被引量：1H指数：1
- 供职机构：暨南大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金“重大新药创制”科技重大专项教育部“新世纪优秀人才支持计划”更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- NDPK-A及突变体与AMPK体外磷酸化及相互作用蛋白研究
- 目的：构建pMO-NDPKA WT及其一系列突变体pMO-NDPKAs（C4S、C109S、C145S、C4/109/145S）真核表达载体，为NDPKA蛋白质相互作用研究提供基本的工具;研究持续活化和kinase de...
- 吕芬
- 关键词：AMPKCFTR免疫共沉淀
- 文献传递
- 氧化还原对NDPK-A及突变体磷酸转移酶活性的影响
- 2012年
- 对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)及其4种半胱氨酸突变体进行诱导表达及纯化,测定它们在氧化还原条件及正常条件下的磷酸转移酶活性,研究氧化还原及二硫键异构对NDPK-A及突变体活性的影响。将实验室之前构建成功的野生型NDPK-A(PBV-NDPK-A)及4种突变型NDPK-A基因(PBV-NDPK-A C4S,PBV-NDPK-A C109S,PBV-NDPK-A C145S,PBV-NDPK-A C4/109/145S)在大肠杆菌中高效表达;以DEAE-sepharose Fast Flow离子交换层析与Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B亲和层析技术纯化目的蛋白;HPLC法测定比较野生型NDPK-A及突变体在氧化还原和正常环境下磷酸转移酶活性。结果显示,NDPK-A及突变体在大肠杆菌中高效表达;经纯化分别获得了均一的NDPK-A蛋白及突变体蛋白,纯度均达到98%;在还原环境下NDPK-A及突变体的磷酸转移酶活性均高于正常环境下的活性,但是在氧化环境下的磷酸转移酶活性明显低于正常环境下。氧化还原环境对NDPK-A结构异构及磷酸转移酶活性有一定的影响,提示氧化还原环境可能调控NDPK-A二硫键的形成,影响蛋白的聚集状态,从而影响蛋白的磷酸转移酶活性,并且NDPK-A结构中可能有更为复杂的氧化还原调控酶活性机制。
- 张志红吕芬高雪杨依丽罗勇熊盛
- NDPK-A C4/109/145S突变体降低磷酸转移酶活性但增加DNase活性
- 2011年
- 核苷二磷酸激酶A(nucleoside diphosphate kinase A,NDPK-A)有广泛的生物学活性,在肿瘤转移和调控中起重要作用.单独抑制NDPK-A中任何1个Cys所形成的二硫键,不会降低NDPK-A的磷酸转移酶活性和DNase活性.本实验通过构建C4/109/145S突变体并研究其生物学效应,为NDPK-A结构与功能的研究提供参考.用定点突变法将NDPK-A的4位、109位和145位Cys突变为Ser,构建pBV220-NDPK-A C4/109/145S和pEGFP-NDPK-A C4/109/145S两种重组质粒.在大肠杆菌中高效表达NDPK-A C4/109/145S突变体,纯化后可获得均一的重组NDPK-A C4/109/145S突变体蛋白.HPLC法和DNA消化法测定发现,C4/109/145S突变体磷酸转移酶活性低于野生型NDPK-A,而DNase活性高于野生型NDPK-A.以A549细胞作为模式细胞的流式细胞仪周期检测表明,C4/109/145S突变体与野生型NDPK-A一致,均可将细胞周期延滞在S期和G2/M期.这些结果证实,NDPK-A结构异构与其磷酸转移酶活性密切相关,其酶活性至少需要1个Cys残基存在,NDPK-A结构中的二硫键也可能是其DNase活性的负调控机制之一,胞内NDPK-A的氧化还原异构可能对细胞周期无显著影响.
- 高雪张志红吕芬钱垂文王一飞熊盛
- 关键词：定点突变细胞周期
- 蓝藻抗病毒蛋白N衍生物的细胞毒性及抗病毒活性检测被引量：1
- 2013年
- [目的]研究蓝藻抗病毒蛋白N(CVN)衍生物(LCVN)对永生化上皮角质形成细胞(HaCaT)的毒性及LCVN凝胶的制备和体外活性检测。[方法]用MTT法测定LCVN对HaCaT细胞株的半数毒性浓度(CC50)以及LCVN对流感病毒毒株A/HK/8/68(H3N2)的半数抑制浓度(IC50);用流式细胞检测法检测LCVN对HaCaT细胞周期与细胞凋亡的影响;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测LCVN凝胶与HIV包膜蛋白GP120的相互作用。[结果]培养24和48 h后,LCVN对HaCaT的CC50分别为(9.25±1.21)与(1.94±0.12)μmol/L,将LCVN做成凝胶后,与HIV外膜蛋白GP120的结合在一定浓度范围内具有剂量关系,LCVN凝胶对A/HK/8/68(H3N2)毒株的IC50为(98.20±0.03)nmol/L。[结论]LCVN对HaCaT细胞的毒性明显小于CVN,当做成凝胶以后LCVN对流感病毒A/HK/8/68(H3N2)具明显抑制作用,并能与HIV包膜蛋白GP120相互作用。
- 陈佳吕芬吴崇超彭舟魏博杨辉陈伟熊盛
- 关键词：流感病毒GP120
- GST-NDPK-A融合蛋白的原核表达及体外互作蛋白的检测
- 2013年
- 旨在了解核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)的功能,通过GST-Pull down技术寻找与其存在体外相互作用的蛋白。以含有目的片段的质粒pBV-NDPK-A为模板,扩增出相应的目的基因片段,将其插入带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达质粒。双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定融合蛋白的表达,并与高表达细胞系A549孵育,进行GST-Pull down试验,并通过LC-MS/MS质谱鉴定体外与NDPK-A相互作用的蛋白。结果显示,成功构建GST-NDPK-A的原核表达载体;在大肠杆菌BL21中诱导表达出可溶性融合蛋白;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了有生物活性的GST-NDPK-A融合蛋白,GST-Pull down试验和质谱鉴定结果发现NDPK-A与Fussel-18、Rrp12体外存在相互作用。
- 吕芬刘忠银兴峰赵振岭陈妙娟张嘉萱陈伟钱垂文熊盛
- 关键词：表达纯化相互作用
