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小鼠角膜基质细胞的KSFM培养基培养法: 2012年; 目的研究使用KSFM培养基能否获取具有增殖能力且保持生物学特性不变的小鼠角膜基质细胞（CSCs）。方法实验研究。将中央区角膜置于EDTA液（20mmol／L）内孵育45min后，用手术显微镊小心剥离角膜上皮层以及内皮层，并将获取的角膜基质置于含300U／mlⅠ型胶原酶的溶液中消化4h。离心后采用DMEM基础培养基、DMEM完全培养基（含10％FBS）以及KSFM培养基重悬细胞常规培养，并以含1U／m1分散酶的EDTA液消化传代细胞。同时，观察细胞并绘制细胞生长曲线；采用逆转录聚合酶链式反应（RT．PCR）检测细胞角膜蛋白多糖（keratocan）mRNA和乙醛脱氢酶（ALDH）mRNA表达情况；采用细胞免疫荧光染色以及蛋白质印迹方法检测细胞keratocan蛋白的表达情况。采用独立样本≠检验对数据进行统计学分析。结果通过胶原酶消化的方法可以从每只小鼠的角膜基质获取约l×l04个单个细胞。RT-PCR结果显示，原代细胞表达CSCs标记物keratocan和ALDH；免疫荧光染色和蛋白质印迹结果显示：原代细胞表达keratocan蛋白。培养于DMEM基础培养基内的原代CSCs无法增殖。培养于DMEM完全培养基内的CSCs可增殖，但第3代细胞不表达keratocan mRNA和ALDH mRNA以及keratocan蛋白。培养于KSFM培养基内的CSCs也可增殖，第3代细胞仍表达keratocan mRNA和ALDH mRNA以及keratocan蛋白，且与原代细胞相比，表达强度差异无统计学意义。结论KSFM培养基不仅能维持小鼠CSCs的生物学特性不变，还能有效促进细胞增殖。; 卢建民李小磊王会芳宋秀君; 关键词：基质细胞角膜细胞增殖生物学特性小鼠

小鼠角膜基质细胞分泌的转化生长因子β2及前列腺素E2对树突状细胞成熟过程的抑制作用被引量：1: 2011年; 背景研究表明，位于角膜中央区的树突状细胞（DCs）完全处于未成熟状态，而位于角膜周边区的DCs则大多处于成熟状态。角膜内的DCs广泛参与多种角膜相关疾病以及角膜移植免疫排斥反应，研究角膜内DEs的成熟状态具有重要意义。目的探讨小鼠角膜基质细胞（CSCs）是否通过分泌转化生长因子β2（TGF—β2）以及前列腺素E：（PGE2）抑制DCs的成熟。方法获取DCs、T细胞以及CSCs培养上清液。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）测定CSCs培养上清液以及新鲜RPMI1640培养基内PGE2和TGF—β2的质量浓度。在DCs成熟过程中，应用TGF—β2中和抗体以及PGE：受体阻滞剂AH6809，并按照处理方式的不同分为对照组、CSCs培养上清液组、AH6809组、TGF—β2中和抗体组、AH6809＋TGF—β2中和抗体组。采用流式细胞技术检测DCs细胞表型CDllc、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达情况，通过葡聚糖内吞实验检测抗原吞噬功能，并通过混合淋巴细胞反应检测刺激T细胞增生的能力。结果ELISA检测结果显示，与新鲜RPMI1640培养基相比，CSCs培养上清液内含有较高质量浓度的TGF—β2和PGE2。与CSCs培养上清液组比较，TGF—β2中和抗体组DCsCD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达均升高，差异均有统计学意义（P〈0．05），葡聚糖的表达降低（P〈0．05），刺激指数（SI）增大（P〈0．05）；AH6809组CD86和MHC-Ⅱ的表达均升高，葡聚糖的表达降低，SI增大，差异均有统计学意义（P〈0．05）；TGF—β2中和抗体＋AH6809组DCsMHC-Ⅱ的表达和SI提高，差异均有统计学意义（P〈0．05）。与对照组比较，TGF—β2中和抗体＋AH6809组DCsCD80、CD86的表达和SI均较低，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论体外培养的小鼠CSCs可以通过分泌TGF—β2及PGE2抑制DCs成熟，且这两种细胞因子可发挥叠加效应。; 卢建民王会芳李小磊连玲艳宋秀君; 关键词：角膜基质细胞转化生长因子Β2 前列腺素E2

姜黄素对角膜基质细胞纤维化的抑制作用被引量：2: 2011年; 背景角膜的创伤或手术可导致角膜基质细胞纤维化，进而形成瘢痕。研究表明姜黄素可明显减轻组织的纤维化程度，但姜黄素是否会影响角膜基质细胞纤维化的研究尚少。目的观察不同质量浓度的姜黄素对小鼠角膜基质细胞向成纤维细胞转化过程的影响，探讨姜黄素抗角膜基质纤维化的作用。方法150只6～8周龄BALB／c小鼠，分离角膜基质细胞并在含质量分数10％胎牛血清（FBS）的DMEM中进行培养，以原代角膜基质细胞重悬于DMEM中并分为5组：（1）空白对照组（DMEM＋10％FBS，含质量分数1％。DMSO，CG组）。（2）低剂量组（CG＋7．5mg／L姜黄素组）。（3）中剂量组（CG＋10mg／L姜黄素组）。（4）高剂量组（CG＋12．5mg／L姜黄素组）。（5）无诱导剂组（DMEM，含1％oDMSO）。上述因素干预7d后，用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测各组中细胞表型keratocan、醛脱氢酶（ALDH）、CD90、decorin、fibronectin一1的表达。用MTS法检测姜黄素对角膜基质细胞增生的影响。制备小鼠角膜冰冻切片，采用免疫荧光技术检测角膜基质细胞内fibronectin-1的表达。结果原代培养的角膜基质细胞呈梭形，为细胞质丰富且核大的角膜基质成纤维细胞。随着姜黄素质量浓度的增加，角膜基质细胞中keratocanmRNA、ALDHmRNA的表达量增加，CD90mRNA和decorinmRNA的表达量减少，差异均有统计学意义（P〈O．05），fibronectin-1mRNA的表达变化差异无统计学意义（P〉0．05）。MTS法检测发现，随着姜黄素质量浓度的增加，对角膜基质细胞增生的抑制率逐渐增加（F=956．00，P〈0．05）。免疫荧光技术检测发现角膜基质细胞中fibronectin-1的表达呈红色荧光。结论姜黄素对离体小鼠角膜基质细胞纤维化有明显的抑制作用，可减轻角膜基质创伤修复过程中的过度纤维化。; 李小磊宋秀君卢建民王会芳张晓融; 关键词：姜黄素角膜基质细胞成纤维细胞纤维化

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王会芳

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