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RNAi靶向人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌的实验研究: 目的构建含有小发夹RNA (shRNA)的针对hTERT基因的重组真核质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA,并探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse trans...; 蔡艳玲; 关键词：RNA干扰真核表达载体 HTERT基因大肠癌 RNA干扰 HTERT基因大肠癌; 文献传递

RNAi沉默hTERT基因诱导大肠癌SW480细胞凋亡被引量：5: 2011年; 目的:探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的表达对大肠癌细胞SW480凋亡的影响。方法:构建携带hTERT小发夹干扰RNA(small hairpin RNA,shRNA)的重组表达载体pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA(简称hTERT-shRNA质粒),脂质体法转染SW480细胞,RT-PCR法检测不同转染时间点SW480细胞中hTERTmRNA的表达。TRAP-PCR-ELISA法检测转染后48h SW480细胞的端粒酶活性,透射电镜观察转染后48h SW480细胞超微结构。结果:hTERT-shRNA质粒转染48h时,hTERT-shRNA组SW480细胞hTERT mRNA表达的抑制率显著高于空白组、脂质体组、NC-shRNA组(75.0%vs39.2%、33.3%、28.0%,P<0.05)。hTERT-shRNA转染组SW480细胞端粒酶活性显著低于空白组、脂质体组、NC-shRNA组(2.242±0.285vs2.756±0.089、2.693±0.225、2.691±0.120,P<0.05)。hTERT-shRNA质粒转染后的SW480细胞体积明显缩小、细胞核固缩、染色质不均匀地沿核膜下聚集、空泡形成增多,出现典型的凋亡形态。结论:RNAi可有效沉默SW480细胞中hTERT的表达,降低SW480细胞端粒酶活性,诱导SW480细胞凋亡。; 蔡艳玲罗小玲葛连英刘爱群谢裕安; 关键词：大肠癌 HTERT 端粒酶凋亡

靶向hTERT基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定被引量：2: 2011年; 目的构建hTERT基因RNAi慢病毒载体,为大肠癌RNAi介导的基因治疗打下基础。方法化学合成3条靶向hTERT基因的siRNA,转染大肠癌细胞SW480,48h后采用RT-PCR方法筛选出一条对hTERT mRNA有明显抑制作用的siRNA。针对已经筛选确定的hTERT基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ酶切后的GP-Supersilencing Vector载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shhTERT慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LV-shhTERT、pGag/Pol、pRev和pVSV-G4质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果 PCR和测序证实,成功构建hTERT shRNA的慢病毒载体LV-shhTERT。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×108UT/ml。结论成功构建了hTERT基因RNAi慢病毒载体。; 刘爱群葛莲英罗小玲蔡艳玲; 关键词：肠肿瘤 RNA干扰慢病毒属 HTERT

pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA对结直肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤的抑制被引量：1: 2012年; 目的:研究靶向hTERT基因的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA对人结直肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤的治疗作用。方法:于裸鼠右侧腋下皮下注射人结直肠癌SW480细胞建立结直肠癌移植瘤动物模型,随机分为生理盐水组(NS组)、pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA组(NC-shRNA组)和pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA组(hTERT-shRNA组),各组连续进行相应治疗6次后,观察肿瘤的生长状况,测量肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线,H-E染色观察肿瘤组织形态学变化,免疫组织化学法检测移植瘤组织中hTERT蛋白的表达,TUNEL法检肿瘤组织中细胞凋亡情况,RT-PCR法检测瘤组织中hTERT mR-NA的表达。结果:与NC-shRNA组和NS组比较,hTERT-shRNA组移植瘤体积增长速度减慢;hTERT-shRNA组移植瘤组织中见肿瘤细胞形态明显改变,凋亡细胞数明显增多[(36.30±5.05)%vs(5.25±1.06)%、(6.95±1.07)%,P<0.01];hTERT-shRNA组hTERT的mRNA和蛋白表达均明显受到抑制(171.42±30.94 vs 146.89±21.43、137.35±25.49,P<0.01;0.39±0.09 vs 0.81±0.335、0.750±0.206,P<0.05)。结论:重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA通过下调hTERT mRNA和蛋白水平的表达促进肿瘤细胞的凋亡,抑制结直肠癌移植瘤的生长。; 蔡艳玲罗小玲葛连英刘爱群谢裕安; 关键词：HTERT基因结直肠癌裸鼠

RNA干扰沉默人端粒酶逆转录酶基因治疗大肠癌移植瘤: 2012年; 目的观察重组质粒pGPU6／绿色荧光蛋白（GFP）／Neo-人端粒酶逆转录酶（hTERT）短发卡RNA（shRNA）对SW480细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法将大肠癌SW480细胞（约5×10^7个）接种于裸鼠，成瘤后将裸鼠分3组，每组8只，瘤体内分别注射20μg pGPU6／GFP／Neo—hTERTshRNA（实验组）、20I-LgpGPU6／GFP／Neo—NCshRNA（阴性对照组）、100μl生理盐水（空白对照组）。观察各组裸鼠体内瘤体生长速度，绘制肿瘤生长曲线，采用聚合酶链反应（PCR）、免疫组织化学技术测定肿瘤组织hTERT表达水平，PCR-端粒重复扩增程序（TRAP）-酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测端粒酶活性，原位末端标记技术（TUNEL）检测细胞凋亡。结果实验组较其他对照组裸鼠移植瘤生长缓慢，hTERTmRNA的相对表达量为0．388±0．093，hTERT蛋白表达的平均灰度值为171．42±30．94，表达水平均明显低于其他对照组（P〈0．05）；实验组端粒酶活性吸光度（A）值A450-A630为0．484±0．359，较其他对照组明显降低（P〈0．05或P〈0．01）；凋亡指数为（36．30±5．05）％，较其他对照组明显降低（P〈0．01）。结论靶向hTERT基因的shRNA瘤内注射能延缓大肠癌细胞SW480裸鼠皮下移植瘤的生长，其机制可能是通过抑制hTERT mRNA和蛋白的表达，抑制端粒酶的活性，促进肿瘤细胞凋亡而发挥作用。; 葛莲英刘爱群罗小玲蔡艳玲耿芳芳; 关键词：RNA干扰端粒酶逆转录酶移植瘤

靶向人端粒酶逆转录酶基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定被引量：3: 2010年; 人端粒酶逆转录酶（hTERT）是端粒酶活性的主要调控因子，对细胞的恶性转化、肿瘤的发生发展意义重大，目前已成为肿瘤基因治疗的理想靶标。我们应用RNA干扰技术设计和构建有效靶向hTERT基因的真核表达质粒，并加以鉴定。; 葛莲英刘爱群罗小玲蔡艳玲; 关键词：人端粒酶逆转录酶基因靶向 HTERT基因 RNA干扰技术真核表达质粒

RNA干扰沉默hTERT基因对大肠癌SW480细胞生物学特性的影响被引量：3: 2012年; 目的观察人端粒酶催化亚单位（hTERT）基因对SW480细胞生物学特性的影响方法将重组质粒pGPU6／GFP／Neo—hTERT—shRNA（hTERT—shRNA）用脂质体转染法导人大肠癌自胞株SW480，实验分4组，每组设3个复孔，分别于转染后24、48、72h，逆转录一聚合酶链反压（RT．PCR）检测hTERTmRNA的表达，免疫细胞化学法检测hTERT蛋白表达，PCR—TRAP-ELISA{；检测端粒酶活性，流式细胞仪检测细胞周期分布，终端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标自（TUNEL）法和透射电镜观察细胞凋亡变化及共聚焦显微镜观察线粒体膜电位（MMP）的改变。结；转染后48hhTERT．shRNA组hTERTmRNA相对表达量为0．32±0．03，hTERT蛋白表达的平均灰月值为209．604-17．10，端粒酶A450～A630值为2．242±0．284，较其他对照组均明显降低（P〈0．05P〈0．01）；G0／G1期细胞为（49．374-1．63）％，增殖指数为（50．60±1．57）％，凋亡指数为22．2％，莲其他对照组均明显增高（P〈0．05，P〈0．01）；凋亡细胞体积明显缩小，表面突起和微绒毛减少，甚!消失，线粒体Rhodamine123平均荧光强度为719．994-17．08，MMP水平显著下降（P〈0．01）。结tRNA干扰（RNAi）沉默hTERT基因能有效抑抑制SW480肿瘤细胞生长，并降低端粒酶活性，诱{肿瘤细胞凋亡。; 葛莲英刘爱群罗小玲蔡艳玲; 关键词：RNA干扰人端粒酶催化亚单位基因沉默大肠癌

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