高健
- 作品数：23 被引量：63H指数：5
- 供职机构：中国人民解放军南京军区军事医学研究所更多>>
- 发文基金：江苏省自然科学基金江苏省应用基础研究计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>
- 抗重组人巨细胞病毒单克隆抗体的制备与鉴定被引量：1
- 2001年
- 为了获得抗人巨细胞病毒 (HCMV)单克隆抗体 (McAb)。采用重组HCMV(rhCMV)gp5 2蛋白片段免疫Balb/c小鼠 ,将免疫鼠脾细胞与Sp2 /0细胞融合 ,经ELISA法筛选阳性克隆及测定效价 ,用免疫印迹法进行特异性鉴定。最终获得 4株 (3E9,5A6,4G12 ,2H2 )能稳定分泌高效价抗rhCMVMcAb的杂交瘤细胞。其培养上清的ELISA效价分别为 :1∶2 0 48,1∶10 2 4,1∶10 2 4,1∶5 12 ;腹水效价分别为 :1× 10 -7,1× 10 -7,1× 10 -6,2× 10 -6。它们分别识别gp5 2蛋白上的 2个不同的抗原表位 ,2H2 识别gp5 2蛋白上的一个表位 ,3E9,5A6和 4G12 识别另一个表位。
- 郑纪山周宗安邓小昭李越希何亮高健王永山李鹤龄
- 关键词：人巨细胞病毒单克隆抗体抗原表位
- 家蚕核多角体病毒载体稳定高效表达HBeAg条件及其初步应用的研究
- 2001年
- 利用已构建的含有HBeAg基因的重组家蚕核多角体病毒rBmHBe ,摸索了HBeAg在家蚕细胞中表达的最佳条件组合 ,细胞接种密度 :(3 .2～ 6 .4)× 10 5细胞 /瓶。病毒接种时间 :细胞接种后 48～ 6 0h。感染复数 (MOI)为 0 .0 4～ 0 .4PFU/细胞。细胞上清经硫铵沉淀、分子筛和阴离子交换柱层析纯化获得电泳纯样品。该样品与E .coli表达的HBeAg相比 ,抗原性高出 10 0倍 ,且与抗HBc交叉反应低至 1%倍。利用该样品建立双抗原夹心法测定抗HBe ,灵敏度高于目前的市售抗HBe试剂盒。
- 高健刁振宇邓小昭周宗安王永山
- 关键词：乙肝病毒E抗原家蚕核多角体病毒纯化乙型肝炎
- 携带猪囊虫表位的嵌合蛋白疫苗的构建及其免疫学研究被引量：6
- 2006年
- 用PCR法将猪囊虫抗原表位n1、n2插入乙肝病毒核心蛋白（HBc）序列的第78～79位之间，将猪囊虫抗原表位n3接在149位之后，再将该序列克隆入pET28a载体中，构建了重组表达质粒pET28a—△c-3n，在大肠杆菌中表达出融合蛋白。命名为PCCE。将PCCE纯化后免疫小鼠，以ELISA检测小鼠的体液免疫应答，Western blot检测抗体的特异性．Dot ELISA验证所选表位的保护性。另用绦虫卵攻击免疫小鼠，以观察疫苗的保护作用。测序结果表明，重组质粒构建成功；SDS—PAGE显示，融合蛋白表达正确，电镜证实有蛋白颗粒形成。对免疫小鼠应用ELISA检测到高滴度抗体；Western blot结果表明。免疫鼠体内诱导出了3种特异性抗体；Dot ELISA结果表明，所逸表位对宿主可能具有保护性。绦虫卵攻击免疫小鼠试验表明，疫苗PCCE的相对保护率为89％。结论：成功地表达和纯化了以HBc为载体的携带3个猪囊虫表位的融合蛋白（PCCE），以PCCE作为疫苗免疫小鼠，能诱导较强的特异性体液免疫反应，免疫小鼠对绦虫卵攻击具有较好的免疫保护作用。
- 邓小昭周宗安刁振宇高健王元伦刘玉郑纪山
- 关键词：猪囊虫疫苗HBCAG免疫反应
- 乙型肝炎病毒感染者B淋巴母细胞系的建立被引量：5
- 2008年
- 目的在体外建立HBV感染者永生化的B淋巴母细胞系(LCL),并鉴定其HLA-A基因亚型。方法利用EB病毒转化外周血B淋巴细胞使之永生化,用环胞菌素A(Cys A)抑制血液中T淋巴细胞的活性;用PCR-SSP法检测血样本的HLA-A基因亚型。结果成功建立了HBV感染者的永生细胞株16株,其中急性乙肝4例,慢性乙肝10例,携带者2例。所有的细胞株冻存后复苏的成功率为100%。细胞株的HLA-A基因亚型包括1101、0201、0101、2403等。结论转化后的LCL保持了良好的稳定性,既可能作为人源单抗的来源,也可作为体外研究HBV特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞。永生化细胞HLA-A基因亚型的鉴定有可能使其成为异体相应亚型体外特异性免疫应答的刺激细胞和靶细胞。
- 唐祖明高健何长伦王一淳戴宇东王寿明郑纪山
- 关键词：乙型肝炎病毒EB病毒永生化B淋巴母细胞系
- 用连续长片段RT-PCR扩增HCV结构基因被引量：1
- 2001年
- 目的与方法 :使用连续长片段 RT- PCR,扩增 HCV的结构基因。 结果 :利用连续长片段 RT- PCR技术 ,结合热启动和两段 PCR一次扩增出长 2 .3kb的 HCV结构基因和部分调控序列 ,并用测量分子质量和限制性酶切的方法进行了鉴定。 结论 :利用长片段 RT- PCR可一次扩增出 C、E1、E2基因和部分 5 - N TR。
- 高健邓小昭王永山刁振宇周宗安何亮
- 关键词：丙肝病毒结构基因限制性内切酶
- 传染性法氏囊病病毒VP2基因高变区序列分析被引量：7
- 2000年
- 根据传染性法氏囊病病毒 (IBDV)VP2基因cDNA序列 ,在VP2基因高变区设计一对引物 ,用RT_PCR方法扩增IBDV分离株JS3和JS4。将扩增片段克隆后以双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。JS3和JS4的同源性最高达 98% ,与已发表的vvIBDV、IBDV变异株、IBDV经典株及IBDV弱毒株核苷酸序列的同源性在 92 %～ 98%之间。根据IBDV的大ORF推导出该片段编码蛋白的氨基酸序列 ,JS3和JS4的同源性最高达 97% ,与上述其它病毒的同源性在 91 %～ 97%之间 ;七肽区的氨基酸序列 ,在强毒株完全相同 ,而在弱毒株有一个丝氨酸突变成了其它氨基酸。
- 王永山周宗安高健刁振宇邓小昭赵新泰李锦军罗函禄
- 关键词：传染性法氏囊病病毒VP2基因高变区同源性分析
- 以HBc颗粒为呈现载体的猪囊虫疫苗的构建及其免疫学研究被引量：3
- 2005年
- 目的构建以HBc为载体的带有三个猪囊虫抗原表位(n1,n2,n3)的重组融合表达质粒pET-Δc-3n,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫小鼠研究其体液免疫效果。方法用PCR法将三个猪囊虫表位分别插入HBc序列的第78-79位之间以及149位之后,再将该序列克隆入pET28a载体中,构建重组表达质粒,用大肠杆菌BL21作宿主菌表达出融合蛋白,并命名为PCCE,纯化后免疫小鼠,检测小鼠的体液免疫应答。用绦虫卵攻击免疫小鼠,并观察疫苗的保护作用。结果测序结果表明重组质粒构建成功,SDSPAGE显示融合蛋白表达正确,并有多聚体形成现象,ELISA检测到高滴度抗体。小鼠体内绦虫卵攻击试验表明疫苗PCCE的相对保护率为89%。结论以HBc为呈现载体的猪囊虫疫苗被成功表达和纯化,该疫苗能诱导较强的体液免疫反应,免疫小鼠对绦虫卵攻击具有较好的免疫保护作用。提示该疫苗PCCE可能具有预防囊虫病的潜在价值。
- 吴琳刁振宇邓小昭高健周宗安刘玉王元伦
- 关键词：猪带绦虫疫苗HBCAG
- 应用RT/PCR-SSCP法分析传染性法氏囊病病毒的变异性被引量：13
- 2001年
- 根据传染性法氏囊病病毒 ( IBDV) c DNA序列 ,在病毒 VP2区域设计 1对引物 ,应用 RT/PCR-SSCP方法对 4个不同时间及不同地域从传染性法氏囊病 ( IBD)病鸡法氏囊组织中分离的 IBDV分离物进行了分析 ,发现 4个 IBDV分离物的 SSCP图谱均存在明显差异。本试验表明 ,IBDV变异在我国普遍存在 ,SSCP方法可用于 IBDV的变异性分析。
- 王永山周宗安高健刁振宇邓小昭罗函禄
- 关键词：传染性法氏囊病病毒鸡病
- 以报告基因荧光素酶研究HPRE功能元件与IFN-α应答的关系被引量：5
- 2006年
- 目的:以荧光素酶(luciferase,LUC)基因为报告基因,探讨HBV转录后调节序列(HPRE)的功能元件(α、β1和β2)对IFNα作用的影响。方法:用PCR法从载体pGEMluc中扩增LUC基因,并克隆入真核表达载体pcDNA3.0中。以含乙肝病毒(HBV)基因组的质粒A01为模板,扩增HPRE(完整的HPRE)、HPREαβ1及HPREβ1β2片段,并分别插入LUC基因的下游。利用脂质体介导的转染法,将重组质粒分别导入人肝癌细胞株HepG2中,用LUC检测系统检测IFNα作用前后LUC表达活性的变化。结果:经测序证实,重组质粒pcDNA3.0luc、pcDNA3.0lucHPRE、pcDNA3.0lucHPREαβ1及pcDNA3.0lucHPREβ1β2构建成功。检测结果显示,IFNα作用前,HPRE、HPREαβ1和HPREβ1β2均能提高LUC的活性,IFNα作用后,HPRE和HPREβ1β2能明显降低LUC的活性,而HPREαβ1对其表达则没有显著影响。结论:HPRE的功能元件β2与IFNα作用的关系最为密切,而功能元件α和β1在IFNα应答中作用甚小,提示IFNα诱导产生的HPRE抑制性结合蛋白很可能是与β2结合的,为进一步研究IFNα在治疗HBV感染和慢性肝炎中的作用机制,以及HPRE抑制性结合蛋白的作用提供了一定的实验依据。
- 姚文娟刁振宇邓小昭孔晶周宗安高健张云
- 关键词：IFN-Α荧光素酶转染
- 不同传染性腔上囊病病毒株结构蛋白表达差异性研究
- 2001年
- 目的 :了解不同传染性腔上囊病病毒株 (ICBDV)结构蛋白表达的差异。 方法 :将在不同时间、地域 ,从鸭、麻雀及传染性腔上囊病发病鸡群中获得的 18株 ICBDV,分别用 SPF鸡、鸡胚和鸡胚成纤维细胞增生 ,经氯仿处理后 ,采用聚乙二醇沉淀、超速离心和不连续蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒 ,并对纯化病毒进行 SDS- PAGE分析。 结果 :病毒主要分布于 40 %蔗糖层 ;鸡源、鸭源、麻雀源 ICBDV在 SDS- PAGE中均出现 5条特异的蛋白带 ,各蛋白带的电泳迁移率毒株间差异不明显 ;15株鸡源 ICBDV结构蛋白 VP2 在不同毒株表达量有较大差异。 结论 :不同传染性腔上囊病病毒株结构蛋白 VP2
- 周宗安王永山邓小昭刁振宇高健张建昌罗函禄
- 关键词：传染性腔上囊病病毒结构蛋白VP2
