崔瑾
- 作品数：12 被引量：49H指数：5
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 肺炎链球菌溶血素的体外表达及活性鉴定被引量：7
- 2011年
- 目的体外扩增肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)的溶血素(pneumolysin,ply)基因,在大肠杆菌中高效表达,并验证其生物活性。方法分离培养D39型肺炎链球菌并提取其基因组DNA,采用PCR技术体外扩增ply基因,体外重组将ply序列克隆到原核表达载体pET28(a)内,测序鉴定后将重组子转化到E.coliRosetta(DE3)中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的Ply重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定后检测其溶血活性和细胞毒性。结果克隆的ply序列与GenBank中的数据相符,并实现了Ply蛋白的可溶表达。所获重组蛋白纯度达到95%。溶血实验显示Ply对人红细胞具有极高的溶血活性,与对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖。细胞毒实验显示Ply对脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)细胞具有明显抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量与时间依赖性,IC50(24h)为1.525μg/ml。结论经测序鉴定ply基因正确扩增,并成功表达、纯化出具有高溶血活性和细胞毒性的Ply蛋白。
- 贺潇袁军王虹李忱炜姜慧董杰崔瑾董姗姗周爱娥张雪梅胥文春尹一兵何於娟
- 关键词：肺炎链球菌溶血素原核表达
- 肺炎链球菌溶血素诱导THP-1细胞凋亡涉及MAPK1/3信号途径
- 2011年
- 目的探讨肺炎链球菌溶血素(pneumolysin,Ply)对人急性单核细胞白血病单核细胞株THP-1细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及机制。方法 MTT法检测Ply对THP-1细胞的增殖抑制。瑞氏染色观察Ply对人THP-1细胞形态的影响。AnnexinV-FITC/PI双标法检测细胞凋亡。琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA片段化现象。免疫组化和Western blot检测MAPK1/3蛋白表达的变化。结果将人THP-1细胞分别与0.05、0.1、0.5、1、2.5、5μg/ml Ply共同孵育后,在24、48、72、96 h用MTT法检测细胞增殖抑制率,发现Ply对人THP-1细胞具有明显的增殖抑制作用,并且呈剂量和时间依赖性,IC50(24 h)为1.31μg/ml;0.05μg/ml和0.1μg/ml Ply分别处理THP-1细胞12 h后,通过瑞氏染色法观察人THP-1细胞可见凋亡小体及核碎裂象等典型的凋亡形态学改变;用0.05μg/ml Ply和0.1μg/ml Ply作用THP-1细胞12 h后细胞早期凋亡率分别为11.83%和48.45%(P<0.05);提取凋亡THP-1细胞DNA,进行琼脂糖凝胶电泳可见典型的"梯状"条带;Ply作用于人THP-1细胞后,胞内MAPK1/3蛋白表达降低(P<0.05)。结论 Ply可诱导人THP-1细胞凋亡,此作用涉及MAPK1/3信号通路的参与。
- 姜慧贺潇袁军王虹李忱炜董杰崔瑾董姗姗周爱娥张雪梅胥文春尹一兵何於娟
- 关键词：肺炎链球菌溶血素THP-1细胞凋亡
- 肺炎链球菌dnaJ基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究
- 崔瑾董杰姜慧周爱娥董珊珊何於娟张雪梅尹一兵王虹
- 肝素对亮氨酸氨基肽酶测定的干扰评价被引量：6
- 2011年
- 目的依据美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP7-A2文件评价肝素对速率法测定亮氨酸氨基肽酶(LAP)的干扰,明确干扰物质带来的结果差异,确保分析方法性能符合临床要求。方法首先,使用2个不同厂家[北京利德曼生化股份有限公司(简称利德曼)、日本第一化学药品株氏会社(简称日本一化)]的试剂同时测定40例患者不抗凝血样本和肝素锂抗凝血样本的LAP,对2种样本的LAP结果进行分析,对有差异的结果进行干扰筛选分析。然后,分别进行"配对差异"试验和"剂量效应"试验以及肝素干扰LAP测定的浓度范围的评价。结果利德曼试剂测定2种样本LAP的结果有差异(P<0.05),日本一化试剂结果无差异(P>0.05)。"配对差异"试验显示肝素对利德曼试剂测定低浓度LAP时存在干扰,而高浓度LAP不存在干扰。"剂量效应"试验结果显示肝素在不同浓度对LAP测定的干扰为非线性函数。初步判定LAP≤97 U/L时,肝素对利德曼试剂产生干扰;在LAP≥149 U/L时,其干扰效应不明显。结论当样本LAP≤97 U/L时,用利德曼试剂测定肝素锂抗凝样本LAP时会对检测结果产生正干扰。为保证LAP检测结果的准确性,如果继续使用利德曼LAP试剂,则需换用无抗凝的干燥管采集样本;如果继续使用肝素锂抗凝管采集样本,可换用日本一化LAP试剂。
- 郭龙华崔瑾陈茶周华友黄宪章庄俊华林莉王建兵
- 关键词：亮氨酸氨基肽酶肝素
- 肺炎链球菌DnaJ对细菌毒力的影响及其在诱导宿主天然免疫反应中的作用
- 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是一种常见的革兰阳性条件致病菌，其引起的肺炎、脑膜炎和败血症等疾病在全球有很高的发病率和死亡率。近20年研究发现S.pn的许多蛋白，可作为炎症介质或...
- 崔瑾
- 关键词：细菌毒力天然免疫反应ELISA检测
- 文献传递
- 川楝素通过线粒体途径诱导人肝癌细胞凋亡被引量：19
- 2011年
- 目的探讨川楝素对人肝癌细胞SMMC-7721(P53+)、Hep3B(P53-)凋亡及其对相关蛋白Bcl-2、Bax和Fas表达的影响。方法 MTT法检测川楝素(0.1～0.9μmol/L)对人肝癌细胞增殖的影响;倒置显微镜观察人肝癌细胞形态学改变;Annexin V法检测早期凋亡率;比色法检测Caspase-3、8、9相对活性改变;免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Fas的表达。结果川楝素显著抑制人肝癌细胞增殖,呈时间-剂量依赖性;形态学观察可见细胞数量减少,黏附力降低,皱缩变圆;0.5μmol/L川楝素作用SMMC-7721、Hep3B细胞72h的凋亡率分别为21.55%、18.35%,经Caspase抑制剂z-VAD-fmk处理后,细胞凋亡率降低;川楝素组SMMC-7721细胞Caspase-3、8、9活性均增高,Hep3B细胞Caspase-3、9活性增高,Caspase-8活性无明显变化;免疫细胞化学法显示,川楝素组SMMC-7721细胞Bcl-2表达减弱,Bax和Fas表达较CTX阳性对照组增强,Hep3B细胞Bcl-2表达减弱,Bax表达增强,Fas表达无明显变化。结论川楝素对P53+和P53-的人肝癌细胞均有抑制增殖、诱导凋亡的作用,涉及线粒体途径的参与,可能是一种通过非P53依赖途径发挥抗癌作用的天然药物。
- 王鹏王进姜慧王虹李忱炜贺潇崔瑾董杰刘小玲何於娟
- 关键词：川楝素凋亡SMMC-7721HEP3BP53
- 肺炎链球菌dnaJ基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究被引量：5
- 2011年
- 目的构建肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)dnaJ基因缺陷菌株,并对其毒力作初步研究。方法采用长臂同源多聚酶链式反应(long flanking homology polymerase chain reaction,LFH-PCR)技术将dnaJ基因替换为红霉素耐药基因(erm)后同源重组于肺炎链球菌,在含红霉素的血平板上筛选出dnaJ缺陷菌株。用PCR鉴定缺陷菌株,以细菌的吸光度值D(600 nm)观察体外缺陷菌株生长情况。将44只BALB/c小鼠采用随机数字表法分为2组,分别用野生菌株和缺陷菌株处理,腹腔攻毒100μl高(2×108cfu)、低(2×106cfu)剂量的菌液,各处理组的不同剂量组均有11只小鼠。记录小鼠死亡时间,计算存活率。60只BALB/c小鼠采用随机数字表分为2组,分别鼻腔滴注含菌量为2×107 cfu的30μl D39菌液和△dnaJ菌液,感染后6、12、24、36、48 h处死每组中的5只小鼠,分别取鼻咽灌洗液、肺组织(匀浆)和心脏血培养,根据每组平均菌落计数结果绘制细菌在宿主体内的定植曲线。结果 PCR结果显示dnaJ基因完全被erm基因所替代,构建dnaJ缺陷菌成功;单个菌落培养基生长情况表明体外热休克状态抑制dnaJ缺陷菌生长;小鼠毒力实验显示腹腔感染缺陷菌株的小鼠存活率可达到100%,而感染野生菌株的小鼠全部死亡,两者比较有统计学差异(P<0.01)。小鼠鼻腔感染模型中,缺陷菌株在各时间点鼻咽灌洗液和肺部的细菌载量均显著低于野生菌株,而且入血后可在感染24 h内被宿主清除,上述差异有统计学意义(P<0.01)。结论采用LFH-PCR技术作基因突变完全替代dnaJ基因,方法简便快捷;dnaJ的缺陷影响细菌在体外应激条件下的生长,并显著降低细菌在宿主体内的毒力和定植。
- 崔瑾张群董杰姜慧周爱娥董姗姗张雪梅尹一兵王虹
- 关键词：肺炎链球菌DNAJ毒力
- 肺炎链球菌假想蛋白SPD0414亚细胞定位及对细菌黏附侵袭的影响
- 2011年
- 目的 为研究肺炎链球菌假想蛋白SPD0414在肺炎链球菌（S.pn）的亚细胞定位,并初步研究其在S.pn黏附和定植中的作用.方法 通过分别在SPD0414的N端和C端融合绿色荧光蛋白（GFP）,共聚焦荧光显微镜观察定位情况.用203野生菌和203△spd0414缺陷菌对鼻咽癌细胞CNE和肺腺癌细胞A549细胞的黏附侵袭实验.体内实验中用203和203△spd0414滴鼻感染BALB/c,在6 h和12 h观察细菌在鼻腔和肺中的载量.结果 无论N端或C端融合的GFP都显示绿色荧光,且整个菌体都显示荧光.与203野生菌相比,203△spd0414缺陷菌对CNE和A549的黏附和侵袭能力均显著下降（P＜0.05）.滴鼻感染BALB/c小鼠,在6 h和12 h,203△spd0414在鼻腔和肺中的细菌载量也明显低于203野生菌（P＜0.05）.结论 肺炎链球菌假想蛋白SPD0414定位于细菌的胞质.该蛋白在细菌的定植和侵袭中发挥了重要的作用.
- 董杰周爱娥崔瑾董姗姗姜慧张雪梅尹一兵王虹
- 关键词：肺炎链球菌GFP融合蛋白亚细胞定位
- 肺炎链球菌dnaJ基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究
- 目的构建肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)dnaJ基因缺陷菌株,并对其毒力作初步研究,为进一步探索宿主对DnaJ的防御应答奠定基础。方法采用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)技...
- 崔瑾董杰姜慧周爱娥董珊珊何於娟张雪梅尹一兵王虹
- 文献传递
- 肺炎链球菌ply基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究
- 2010年
- 目的 构建肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,Sp）溶血素基因（pneumolysin,ply）缺陷菌株,并对其毒力作初步研究,为进一步探索宿主对溶血素的防御应答奠定基础.方法 采用长臂同源多聚酶链反应（LFH-PCR）技术将ply基因替换为红霉素耐药基因（erm）后同源重组于肺炎链球菌,在含红霉素的血平板上筛选出ply缺陷菌株.用PCR鉴定缺陷菌株,观察体外缺陷菌株生长情况,并在小鼠体内感染模型研究其毒力侵袭变化.结果 PCR结果显示ply基因完全被erm基因所替代,构建ply缺陷菌成功 单个菌落培养基生长情况表明ply基因缺陷并未对细菌的体外生长造成影响 但在小鼠鼻腔感染模型中,缺陷菌株入血时间（6 h）明显晚于野生菌株（2 h）,且各时间点的菌量均显著低于野生菌株,两者比较差异有统计学意义（P＜0.01） 小鼠腹膜感染模型显示野生菌株半数致死时间为3 d,而缺陷菌株半数致死时间为18d,两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 采用LFH-PCR技术作基因突变完全替代ply基因,方法简便快捷 ply的缺陷不影响细菌在体外的生长,但可显著降低细菌在宿主体内的毒力和侵袭.
- 李忱炜袁军王虹贺潇董杰崔瑾姜慧张雪梅胥文春何於娟
- 关键词：肺炎链球菌溶血素毒力
