内标准基因对于转基因植物及其产品的定性定量PCR检测起着决定性的作用,木薯内标准基因的系统研究是木薯转基因成分检测的基础。在木薯的DFCI(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html)数据库中,选择了有可能作为木薯内标基因的一些EST序列,包括亲环蛋白2(cyclophilin type 2,DB934316)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因B亚单位(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B subunit,TC445)GAPDH、Actin基因(TC2158与TC3381的拼接序列)、Alpha-tubulin(TC8072)基因,Polyubiquitin(TC9946),亚麻苦苷酶(linamarase,TC1540)6个基因序列,设计了7对定性PCR的引物(CP2、Actin、GAPDH、PUBQ2、Tublinα1、Tublinα2和LAM1),并进行了种内一致性、稳定性和种间特异性测试分析。结果表明,只有木薯的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因B亚单位的GAPDH定性PCR引物扩增系统在木薯的22个不同品种中都能够得到一致性稳定性的扩增结果,在大戟科其他植物及其他非大戟科植物没有发现非特异性扩增产物。另外6个基因(CP2、Actin、PUBQ2、Tublinα1、Tublinα2和LAM1)的定性PCR引物扩增系统在大戟科其他植物及非大戟科植物中都有非特异性的扩增产物。因此GAPDH定性PCR引物扩增系统初步符合内标准基因的种内一致性,稳定性,种间特异性的特点,可应用于转基因木薯成分定性PCR检测。
根据在香蕉果实抑制缩减文库中获得的1个14-3-3蛋白基因片段,采用PCR和RACE相结合的方法从香蕉(Musaacuminate L. AAA group cv. Brazilian)cDNA文库中筛选到其全长cDNA序列。序列测定和Blastx比对分析结果表明,该cDNA全长1 037 bp,含有1个完整的阅读框,其编码区编码261个氨基酸残基,具有植物14-3-3蛋白基因的保守结构域,并与其他植物来源的14-3-3蛋白具有很高的同源性,将其命名为Ma-14-3-3b(Musa acuminate 14-3-3)。采用遗传进化系统发育树的分析结果表明,Ma-14-3-3b与来源于单子叶植物的多数14-3-3蛋白基因序列在同一个进化枝上。采用RT-PCR对其在香蕉果实发育不同时期的表达进行分析结果表明,在香蕉果实发育的不同时期差异表达,推测其可能在果实的发育中起作用。
通过简并引物和降落PCR方法结合RACE(rapid amplification of c DNA end)技术在香蕉果实c DNA文库中获得2个14-3-3基因,分别命名为Ma14-3-3d和Ma14-3-3h,把Ma14-3-3d和Ma14-3-3h与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i进行多重序列比对和同源性比较。结果表明:Ma14-3-3d和Ma14-3-3h与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i具有较高的同源性,同时具有一定的差异性。遗传进化分析结果表明,Ma14-3-3d与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i同属于non-ε类14-3-3基因,Ma14-3-3h属于ε类14-3-3基因。RT-PCR分析结果表明,Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉不同器官中差异表达,Ma14-3-3d在香蕉的根、茎、叶、花和果中均有表达,且在茎、叶和花中的表达量高于根和果;Ma14-3-3h在根、花和果中的表达量较高,而在茎和叶中的表达量较低。q RT-PCR分析结果表明,Ma14-3-3d基因的表达明显受乙烯的诱导,而Ma14-3-3h在正常成熟、乙烯处理与1-MCP处理的果实中表达量均很低,与果实成熟的相关性不明显。推测Ma14-3-3d可能与香蕉果实成熟密切相关,可能参与乙烯调控果实成熟过程中的生物合成与信号转导。
[Objective] The aim of the study is to clone and analyze the gene encoding 14-3-3 protein from banana. [Method] Combined with PCR amplification, RACE (rapid amplification of cDNA ends) technique was employed to clone 14-3-3 gene from banana; then the amplified sequence was sequenced and homologically analyzed. [Result] A new cDNA homologous with 14-3-3 protein genes were obtained by RT-PCR and RACE ( rapid amplification of cDNA ends ) approaches. The full length of this cDNA was 866 bp encoding 197 amino acids. Alignment of deduced amino acid sequence with those from other plants revealed that the cDNA shared high homology with 14-3-3 protein genes from other plants, and was designated as Musa acuminata 14-3-3 gene (Ma-14-3-3d). Phylogenetic analysis reveals that Ma-14-3-3d has closer genetic relationship with those from monocotyledon species than those from other species. [Conclusion] Ma-14-3-3d belongs to the same lineage of 14-3-3 from monocotyledon.
