沈大斌
- 作品数：6 被引量：5H指数：1
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- 人趋化因子巨噬细胞炎性蛋白3α的克隆与原核表达
- 2006年
- 目的克隆人趋化因子MIP-3 alpha基因,表达并初步纯化MIP-3 alpha融合蛋白。方法从人扁桃体中提取总RNA,再进行RT-PCR,扩增MIP-3 alpha成熟蛋白基因,并在5′和3′端分别添加NcoI和EcoRI酶切位点,通过与之对应的存在于pET32a(+)质粒上的酶切位点重组于pET32a(+)载体上,转化E.coli BL21trxB(DE3),筛选阳性克隆,酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性,缺失突变MIP-3 alpha序列前端多余碱基,获得MIP-3 alpha天然蛋白表达载体pET32a(+)/MIP-3 al-pha,SDS-PAGE分析其表达,Western Blot验证融合蛋白。大量表达并初步纯化MIP-3 alpha融合蛋白。结果成功克隆了MIP-3 alpha基因,表达并初步纯化得到MIP-3 alpha融合蛋白。结论在大肠杆菌中成功构建的MIP-3 alpha硫氧还蛋白融合表达载体,以可溶性蛋白的方式表达MIP-3 alpha硫氧还蛋白。
- 顾涛罗福康沈大斌龚小云郑红
- 关键词：ALPHA蛋白纯化
- 人趋化因子SLC在大肠杆菌中的表达与初步纯化被引量：1
- 2006年
- 目的确立人趋化因子SLC在大肠杆菌中的表达条件和初步纯化条件。方法将pET32a(+)/SLC分别转化大肠杆菌AD494(DE3)、BL21trxB(DE3)、BL21trxB(DE3)plusS,选择最佳宿主菌,优化诱导表达的条件,将大量表达的目的蛋白经金属离子亲和层析、除盐、肠激酶酶切、阳离子交换进行初步纯化。结果pET32a(+)/SLC最佳宿主菌为BL21trxB(DE3),优化的表达条件为37℃、1mmol/L IPTG诱导3h,SDS-PAGE分析可见,表达蛋白的大小约为30kd,占菌体总蛋白的50%以上,可溶性蛋白约占50%。用SLC多克隆抗体进行Western blot分析显示,在30kd处出现单一阳性条带,而对照的pET32a(+)/BL21trxB(DE3)诱导菌则无此反应。SLC经一系列纯化步骤得到初步纯化。结论初步建立pET32a(+)/SLC在宿主菌BL21trxB(DE3)中表达和纯化的方法。
- 罗福康沈大斌郑红顾涛
- 关键词：宿主菌蛋白纯化趋化因子大肠杆菌
- 趋化因子MIP-3α的克隆与表达被引量：2
- 2005年
- 目的 克隆人趋化因子MIP 3α基因,表达并初步纯化MIP 3α融合蛋白。方法 从扁桃体中提取总RNA ,再进行RT PCR ,扩增MIP 3α成熟蛋白基因,并在5’和3’分别添加NcoI和EcoRI酶切位点,通过这两个酶切位点重组于pET3 2a(+ )载体上,转化E .coli.DH5α,筛选阳性克隆,酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性,缺失突变获得MIP 3α天然蛋白表达载体pET3 2a(+ ) /MIP 3α,SDS PAGE分析其表达,Westernblot验证融合蛋白。大量表达并初步纯化MIP 3α融合蛋白。结果 成功克隆了MIP 3α基因,表达并初步纯化得到MIP 3α融合蛋白。结论 构建的MIP 3α硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式表达MIP 3α硫氧还蛋白。
- 罗福康郑红沈大斌
- 关键词：MIP-3ΑWESTERNBLOT蛋白纯化
- 人趋化因子受体CCR6的克隆、表达及其功能分析
- 2006年
- 目的构建人趋化因子受体6(CCR6)cDNA序列的真核表达载体,并在HEK293细胞中表达,为研究CCR6生物学功能和筛选CCR6拮抗剂奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人扁桃体克隆CCR6受体的DNA片段,并将该片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CCR6;将该质粒pcDNA3.1(+)-CCR6转染HEK293细胞,用流式细胞术检测转染pcDNA3.1(+)-CCR6质粒的HEK293细胞;采用体外趋化实验、钙流实验,验证转染pcDNA3.1(+)-CCR6质粒的HEK293细胞表面表达的CCR6的生物学活性。结果经RT-PCR获得了编码人CCR6受体的DNA片段,构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CCR6;转染HEK293细胞,经流式细胞仪检测、趋化实验、钙流实验证实,表达CCR6的HEK293细胞具有趋化因子受体CCR6的生物学活性。结论重组人趋化因子受体CCR6克隆成功,并在HEK293细胞中获得了表达,为研究CCR6的生物学功能及筛选CCR6拮抗剂奠定了基础。
- 沈大斌龚小云顾涛罗福康郑红
- 关键词：PCDNA3.1(+)克隆
- 人趋化因子ELC的克隆与表达被引量：1
- 2005年
- 目的 克隆人趋化因子ELC基因,表达并初步纯化ELC融合蛋白。方法 从扁桃体中提取总RNA ,再进行RT PCR ,扩增ELC成熟蛋白基因,并在5′和3′分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点,通过这两个酶切位点重组于pET3 2a(+ )载体上,转化E .coliDH5α,筛选阳性克隆,酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性,缺失突变获得ELC天然蛋白表达载体pET3 2a(+ ) ELC ,SDS PAGE分析其表达,Westernblot验证融合蛋白。大量表达并初步纯化ELC融合蛋白。结果 成功克隆了ELC基因,表达并初步纯化得到ELC融合蛋白。结论 构建的ELC硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式表达ELC硫氧还蛋白。
- 罗福康沈大斌郑红
- 关键词：缺失突变WESTERNBLOTTING蛋白纯化
- 重组嵌合毒素Dsg3EC_(1-2)PE40对寻常型天疱疮患者T、B淋巴细胞的影响被引量：1
- 2005年
- 目的探讨重组嵌合毒素Dsg3EC1-2PE40对寻常型天疱疮患者外周血淋巴细胞的影响.方法对重组嵌合毒素Dsg3EC1-2PE40进行表达,并分离纯化;分别以不同浓度重组嵌合毒素作用于寻常型天疱疮患者外周血淋巴细胞,通过ELISPOT法、MTT比色试验及3H-TdR掺入试验来观察重组嵌合毒素对T、B淋巴细胞的影响.结果纯化后的重组嵌合毒素纯度达80%以上,它能够特异性与天疱疮抗体IgG结合,而与正常人IgG不结合.重组嵌合毒素可使寻常型天疱疮外周血产生抗体的B细胞数量减少约40%左右;在重组嵌合毒素作用下,T细胞的增殖、代谢较重组Dsg3EC1-2明显降低,两者间差异有统计学意义(P<0.01).结论重组嵌合毒素Dsg3EC1-2PE40可以抑制寻常型天疱疮外周血B细胞的抗体产生作用,对寻常型天疱疮外周血T细胞具有明显的抑制或杀伤作用.
- 翟志芳刁庆春郝飞沈大斌钟白玉唐书谦
- 关键词：天疱疮免疫毒素类桥粒芯糖蛋白寻常型天疱疮B淋巴细胞外周血淋巴细胞
