王海飞
- 作品数：14 被引量：55H指数：4
- 供职机构：扬州大学动物科学与技术学院更多>>
- 发文基金：江苏省自然科学基金江苏省农业科技自主创新基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生化学工程更多>>
- 基于CRISPR/Cas9技术构建猪KLF4基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析
- 2024年
- 【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9技术构建Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)基因敲除的猪小肠上皮细胞,并探究KLF4基因敲除对于细胞活性和细胞周期的影响。【方法】在猪KLF4基因转录本第1外显子区域设计3条sgRNAs(sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3),经退火形成的双链DNA与线性化pGK1.1载体连接,产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行鉴定,并将重组载体转染至猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)。PCR扩增敲除位点附近序列,并通过测序判断sgRNA敲除效率;利用CruiserTMEnzyme酶切鉴定阳性细胞克隆,通过TA克隆测序鉴定敲除序列;利用Western blotting检测基因敲除细胞中KLF4蛋白表达情况。利用CCK-8和流式细胞术检测KLF4基因敲除后细胞活性和细胞周期的变化。【结果】重组载体测序结果显示,sgRNAs与pGK1.1成功连接。分析敲除效率发现,3个sgRNAs均可对靶序列进行敲除,其中sgRNA3有较高的敲除效率。PCR产物经CruiserTMEnzyme酶切筛选出2个阳性单克隆细胞。TA克隆测序分析发现,KLF4基因2个等位基因序列分别缺失116和137 bp。Western blotting结果表明,KLF4基因敲除细胞中未见KLF4蛋白表达。细胞活性及细胞周期分析显示,敲除KLF4基因极显著抑制了细胞活性(P<0.01),并导致G0/S细胞周期阻滞。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了KLF4基因敲除的IPEC-J2细胞,且KLF4基因敲除可抑制细胞活性,并引起G0/S细胞周期阻滞。KLF4基因敲除细胞可为进一步探究KLF4基因功能及分子机制提供材料。
- 董娇陆繁方晓敏陈瑜哲包文斌王海飞
- 关键词：细胞活性细胞周期
- 东串猪Mx1基因第14外显子多态性及组织表达谱分析被引量：1
- 2018年
- 为了揭示抗黏液病毒1(myxo-virus resistance 1,Mx1)基因第14外显子在东串猪群体中多态性分布及组织表达特性,试验利用PCR-RFLP技术测定东串猪Mx1基因第14外显子的多态性,同时利用实时荧光定量PCR技术分析其组织特异性表达规律。结果表明,东串猪Mx1基因第14外显子Hin6Ⅰ酶切位点存在G36T突变,可检测到AA、AB、BB 3种基因型,AB为优势等位基因型,A为优势等位基因;东串猪Mx1基因的多态信息含量(polymorphism information content,PIC)值为0.360,表现为中度多态;Mx1基因在淋巴、肺脏、脾脏、十二指肠、空肠、回肠组织中表达量较高。本研究初步揭示了东串猪Mx1基因第14外显子的多态性分布,为探讨其作为有效遗传标记的可行性提供参考。此外,Mx1基因在多种免疫组织中高表达,可能与机体抵抗病原感染有关。
- 吴嘉韵朱恩昊王海飞吴圣龙包文斌
- 关键词：多态性表达谱
- ESR和FSHβ基因与母猪乳头数的关系研究被引量：8
- 2008年
- 用PCR-RFLP和PCR方法对144头大约克母猪的ESR和FSHβ基因进行分型,分析了ESR和FSHβ不同基因型和合并基因型大约克母猪的乳头数差异。结果表明:ESR和FSHβ基因对大约克母猪乳头数均有显著影响。无论ESR基因还是FSHβ基因,BB基因型均为乳头数最多的基因型,而BBBB是乳头数最多的合并基因型。从基因型效应来看,ESR和FSHβ基因型为BB的母猪平均乳头数分别为14.45和14.37,而合并基因型BBBB的母猪平均乳头数为14.73,说明合并基因型的遗传效应大于单个基因型的效应,但不是各个基因型效应的简单加和。
- 赵西彪杨欢利刘萍王海飞丁家桐
- 关键词：ESRFSHΒ乳头数大约克母猪
- 猪缝隙连接蛋白43(GJA1)结构和功能的预测与分析被引量：4
- 2018年
- 为了探究猪缝隙连接蛋白43(GJA1)的结构和相关功能,本研究对16个哺乳动物的GJA1蛋白进行多重序列比对及系统发育分析,并通过相关的生物信息学数据库和软件从理化性质、蛋白修饰位点、跨膜区、亚细胞定位、二级结构、三级结构、多态位点、功能区域和互作蛋白等方面对猪GJA1蛋白的结构和功能进行系统分析。系统发育分析结果显示,GJA1蛋白在16种哺乳动物中变异未达到饱和,物种间遗传距离小且同源性高,其中猪与马的GJA1蛋白序列最为接近,同源性达93.3%,在进化树上的分类也证实了这一结果。蛋白结构分析结果显示,猪GJA1蛋白分子质量为43.08ku,理论等电点为8.88,由20种氨基酸组成,不稳定指数为44.06,平均疏水系数为-0.240,脂溶指数为82.67,不分泌信号肽,有4个跨膜区、6个O-糖基化位点和38个磷酸化位点,最有可能位于细胞质膜和高尔基体内,其二级结构和三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。蛋白功能分析结果显示,在猪GJA1蛋白的CDS序列中有2个超级家族结构功能区域和6个错义突变位点,且猪GJA1蛋白还与ZO-1和Cx36等蛋白及多种蛋白激酶存在相互作用。本研究通过生物信息学分析系统地揭示了猪GJA1蛋白的结构和功能,为后续进一步研究GJA1蛋白在猪体内发挥生物学功能的遗传调控机制提供一定的理论支持。
- 戴开宇曹越郜重丞王海飞包文斌吴圣龙
- 关键词：蛋白结构蛋白功能
- 猪胚胎发育差异性影响因素与成活率
- 2007年
- 母猪妊娠期胚胎死亡是影响猪窝产仔数的主要因素而导致妊娠期胚胎死亡的原因十分复杂,其中胚胎差异性是导致胚胎死亡的重要因素之一。本文阐述了胚胎发育差异性与成活率的关系。
- 赵西彪杨欢利王海飞于钦秀丁家桐
- 关键词：胚胎成活率
- 猪METTL3基因表达水平与DON诱导IPEC-J2细胞损伤的关系被引量：2
- 2022年
- 旨在初步探究猪m^(6)A甲基化酶METTL3基因表达水平与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)诱导猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)损伤的关系。本研究构建了稳定干扰METTL3基因表达水平的IPEC-J2细胞系,用1μg·mL^(-1) DON诱导METTL3干扰组和对照组猪肠上皮细胞48 h,通过实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因、免疫相关基因、抗氧化酶相关基因表达水平,同时测定细胞增殖活性、细胞周期、细胞凋亡以及活性氧(ROS)水平。结果显示,与对照组相比,干扰组免疫相关基因TNF-α、IL-6、IL^(-1)2的表达水平产生了显著变化(P<0.05),凋亡相关基因Bax、Caspase3、Caspase9表达量均显著下降(P<0.05),抗氧化酶相关基因GPXs、CuZn-SOD、CAT表达量显著上升(P<0.05);细胞增殖活性显著提高,细胞总凋亡率显著降低(P<0.05),ROS水平极显著降低(P<0.01)。本研究结果表明,METTL3基因表达水平降低能一定程度地帮助IPEC-J2细胞抵抗因DON诱发的细胞凋亡和炎症。METTL3表达下调有利于缓解DON对于细胞损伤产生的一系列炎症反应,为今后细致研究RNA甲基化修饰在仔猪抵抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇损害调控中的作用机制提供了理论基础。
- 许写石东风吴嘉韵吴圣龙王海飞王海飞包文斌
- 关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇
- 猪胚胎发育差异性影响因素与成活率被引量：3
- 2008年
- 母猪妊娠期胚胎死亡是制约增加猪窝产仔数的瓶颈。导致妊娠期胚胎死亡的原因十分复杂,其中胚胎差异性是导致胚胎死亡的重要因素之一。本文就胚胎差异性影响因素与成活率的关系作一综述。
- 赵西彪杨欢利王海飞于钦秀丁家桐
- 关键词：胚胎成活率
- 猪miRNA-215前体序列突变对miRNA-215表达及大肠杆菌抗性的调控作用分析
- (目的)microRNAs 在动物生长发育与疾病发生过程中均发挥着重要的调控作用,其功能序列区的遗传变异能够造成其相关功能的变化.本课题组前期通过高通量测序并结合荧光定量验证筛选出miR-215 是与断奶仔猪E.coli...
- 王海飞孙丽郜重丞吴圣龙包文斌
- 关键词：大肠杆菌
- 抗生素对仔猪肠道微生物的影响被引量：7
- 2017年
- 本研究旨在从肠道微生物的角度探究抗生素的作用机制,为今后绿色抗生素替代品添加剂的研究提供理论基础和参考。试验选用6头30日龄的杜×长×大三元杂交去势公猪,随机分为2组,分别为基础饲粮组(不添加抗生素)和抗生素组(基础饲粮中添加0.12%复合抗生素),每组3个重复,每个重复1头猪。试验期为35 d。结果表明:抗生素组肠道微生物物种多样性较基础饲粮组更为丰富;抗生素组厚壁菌门(Firmicute)/拟杆菌门(Bacteroidetes)(F/B)比例较高,因此添加抗生素有利于仔猪体内脂肪的贮存;从肠道微生物的角度考虑,抗生素可能是通过促进L7A_E11、Flexispira、粪球菌属(Coprococcus)等菌属,抑制光岗菌属(Mitsuokella)、巨球菌属(Megasphaera)、柔嫩菌属(Faecalibacterium)等菌属从而发挥预防疾病、提高成活率和促进生长的作用;使用PICRUSt进行功能预测,抗生素在脂类生物合成蛋白质、甲烷代谢、转运蛋白、转录因子、转录机制、RNA转运和脂肪酸生物合成等通路中发挥了重要的作用。由此可见,抗生素可以通过调节仔猪肠道微生物,加速仔猪体内脂肪的贮存,加速断奶仔猪对粗纤维的降解作用,促进短链脂肪酸的生成,从而发挥预防疾病、提高成活率和促进生长等作用。
- 刘颖王海斌周刚霍永久董丽王海飞包文斌喻礼怀
- 关键词：RRNA抗生素肠道微生物
- 初情期前后GPR54 mRNA在猪下丘脑-垂体-卵巢轴内的定位
- 2009年
- 研究应用原位杂交技术检测GPR54 mRNA在苏姜猪下丘脑-垂体-卵巢轴中的分布定位。在60日龄和初情期(160日龄)2个不同发育阶段的下丘脑-垂体-卵巢轴中均检测到GPR54 mR-NA阳性杂交信号,结果表明:苏姜猪2个不同发育阶段的3种组织中均有GPR54 mRNA表达。其中下丘脑以弓状核、腹内侧核的阳性杂交信号最强,尤其是在初情期更明显;各级卵泡中以初情期时成熟卵泡的阳性杂交信号最强。
- 周春宝汪劲能陆艳凤刘萍王海飞丁家桐
- 关键词：GPR54初情期原位杂交技术下丘脑-垂体-卵巢轴
