王鑫廷
- 作品数：10 被引量：6H指数：1
- 供职机构：天津医科大学更多>>
- 发文基金：国家杰出青年科学基金国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- TGF-β参与IL-18刺激Th1型细胞分泌IL-9
- 最近的报告发现的CD4+Th细胞亚群,在特定的细胞因子环境下,有能力改变他们的基因表达模式。我们之前发现Thl细胞在受到抗原OVA,IL-2和IL-18刺激下可以产生IL-3,IL-9,IL-13和粒细胞巨噬细胞集落刺激...
- 王鑫廷
- 关键词：IL-18IL-9TGF-Β
- 文献传递
- 重组原核质粒GST-hTudor-SN-SN（1～4）的构建及表达
- 2010年
- 目的 将人类Tudor-SN（tudor staphylococcal nuelease）蛋白SN（1～4）基因片段分别定向连入pGEX-4T-1质粒,使Tudor-SN蛋白sN各功能片段与（;＂蛋白在大肠埃希菌BL21细胞内融合表达.方法 以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的 基因,利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切法将目的 片段连接纠pGEX-4T-1载体卜,再将构建成功的GST-hTudor-SN-SN（1～4）重组质粒转化人大肠埃希菌BL-21内,IPTG诱导表达后再以考马斯亮蓝染色法检测GST融合蛋白的表达.结果 以单/双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,考马斯亮监染色法观察到GST融合蛋白的正确表达.结论 重组原核GST.hTudor-SN-SN（1-4）质粒成功构建和表达.
- 苏超朱梦瑜高星杰王鑫廷张桂敏付晓葛林杨洁
- 关键词：PGEX-4T-1重组质粒融合蛋白
- 一种高表达SND1-FLAG转基因小鼠模型的制备方法
- 一种高表达SND1-FLAG转基因小鼠模型的制备方法。SND1蛋白与哮喘、过敏、结肠癌、肺癌等多种疾病相关。本发明即为针对位于染色体6A3.3的鼠源SND1转基因小鼠构建方法。主要流程：首先构建pInsulator-CA...
- 杨洁高星杰魏民新王鑫廷段中潮辛灵彪
- 文献传递
- SND1转基因小鼠的构建被引量：1
- 2016年
- 目的:构建SND1过表达的转基因小鼠模型。方法:利用对小鼠SND1基因转录本构建SND1过表达载体p Insulator-CAG-3×FLAG-SND1,利用受精卵原核注射技术,将外源线性p Insulator-CAG-3×FLAG-SND1转基因载体注射到受精卵细胞核内,将存活受精卵进行胚胎移植制备SND1转基因小鼠,用PCR、RT-PCR技术鉴定转基因小鼠是否构建成功。结果:成功构建过表达SND1基因的转基因小鼠模型,为进一步研究SND1基因在动物体内的生物学功能奠定基础。
- 左志宇辛灵彪杨洁王鑫廷
- 关键词：转基因小鼠
- 活细胞内以光漂白荧光损失(FLIP)技术分析HuR蛋白的应激动力学行为
- 2014年
- 人类抗原R(human antigen R,HuR)是一种多功能RNA结合蛋白,参与细胞应激颗粒(stress granules,SGs)的构成。SGs是细胞在受到外界环境刺激时在胞浆中形成的颗粒状结构。该研究是利用光漂白荧光损失(fl uorescence loss in photobleaching,FLIP)技术对活细胞内的HuR蛋白颗粒进行应激动力学分析。首先,利用脂质体将RFP-HuR重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,以Western blot和细胞免疫荧光实验确定是否实现对于HuR蛋白的红色荧光蛋白(red fl uorecent protein,RFP)标记;然后以405 nm激光束脉冲式重复光漂白HuR应激颗粒,分别监测同一漂白细胞内的其他HuR颗粒以及核内荧光信号,并以邻近的未漂白细胞作为对照组。实验结果表明,转染重组质粒后可有效表达RFP-HuR融合蛋白,且与SGs标记蛋白G3BP存在共定位关系。在第一个光漂白循环,漂白区荧光密度便从2 500 a.u.降低至0 a.u.;而经过约12个漂白循环(240 s)后,邻近HuR颗粒的荧光密度从漂白前的1 800 a.u.左右降低并维持在200 a.u.左右,表明活细胞内的HuR颗粒呈现高度的动态性;而胞核区荧光密度亦从4 400 a.u.降低至2 000 a.u.左右,表明HuR蛋白是一种核浆穿梭蛋白,在SGs、胞浆及胞核之间存在一定的动态平衡。利用FLIP技术可以分析并比较SGs不同成分的应激动力学属性,有助于进行SGs相关临床疾病的分子机制探讨。
- 高星杰张毅付雪苏超张春燕张桂敏尹洁王鑫廷姚智杨洁
- 关键词：活细胞荧光标记
- 人GRP94基因慢病毒载体构建及稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌HeLa细胞株筛选及鉴定被引量：2
- 2017年
- 目的:构建人葡萄糖调节蛋白94(GRP94)基因慢病毒载体,筛选稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌细胞株,筛选GRP94结合蛋白,为探讨GRP94对宫颈癌的调控作用提供细胞模型。方法:采用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增GRP94基因片段,连接到慢病毒载体pLVX-IRES-Puro中,获得重组载体。瞬时转染293T细胞,采用Western blot法检测GRP94蛋白表达量。pLVX-FLAG-GRP94重组质粒通过与包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。以慢病毒感染HeLa细胞,筛选并鉴定稳定表达GRP94蛋白的细胞株。用稳定表达FLAG-GRP94的HeLa细胞株,银染后利用质谱筛选结合蛋白,并经免疫共沉淀验证。结果:重组慢病毒载体经双酶切和基因测序比对鉴定正确。HeLa细胞经慢病毒感染、药物筛选后获得的稳定表达株中GRP94蛋白表达量高于野生型HeLa细胞(P<0.01)。成功钓取出一种与肿瘤发生发展密切相关的SND1蛋白。结论:成功构建了GRP94基因慢病毒载体pLV_X-FLAG-GRP94,并筛选出稳定表达GRP94蛋白的HeLa细胞株,为进一步明确肿瘤的发生、发展机制奠定了基础。
- 杨娅楠王媛左志宇王鑫廷杨洁
- 关键词：葡萄糖调节蛋白94慢病毒载体LA
- 人Calnexin基因慢病毒载体及稳定表达Calnexin蛋白的宫颈癌细胞株构建被引量：1
- 2018年
- 目的构建人Calnexin基因慢病毒载体及稳定表达Calnexin蛋白的人宫颈癌Hela细胞株,为进一步探讨Calnexin基因对宫颈癌潜在的调控作用提供细胞模型。方法采用TRIzol提取宫颈癌细胞Hela细胞株总RNA,RT-PCR法逆转录出含有目的基因Calnexin的cDNA序列;根据Calnexin的cDNA序列,选择EcoR1、Bam H1限制性酶切位点作为目的位点,设计FLAG-Calnexin基因的PCR引物;利用PCR法从Hela细胞cDNA中扩增出FLAG-Calnexin基因片段,连接到慢病毒载体pLVX-IRES-puro中,得到重组慢病毒pLVX-FLAG-Calnexin质粒。将慢病毒包装质粒与pLVX-FLAG-Calnexin重组质粒共转染到人肾上皮293T细胞中,获得携带FLAG-Calnexin基因序列的重组慢病毒。将慢病毒感染Hela细胞24 h,在细胞培养基中加入1.0μg/m L嘌呤霉素,药筛48 h。最后筛选出稳定表达FLAG-Calnexin蛋白的Hela细胞,采用Western blotting法、Real-time PCR法检测该细胞内的Calnexin蛋白及mRNA。结果构建完成的重组质粒经菌落PCR、重组质粒的双酶切、质粒PCR验证后,条带位置对应片段大小与目的基因大小一致,且经质粒测序后与Calnexin基因片段比对一致。经过慢病毒感染、药物筛选后得到的Hela细胞中的Calnexin蛋白及mRNA的相对表达量分别为2.14±0.25、6.15±0.21,高于野生型Hela细胞及转入空载的对照细胞(P均<0.01)。结论成功构建了人Calnexin基因慢病毒载体,同时建立、筛选出了能够稳定表达Calnexin蛋白的Hela细胞株,为进一步探讨Calnexin在宫颈癌发生发展中的作用提供了细胞模型。
- 李宏帅王鑫廷王媛杨洁
- 关键词：慢病毒载体宫颈癌细胞HELA细胞
- Tudor-SN蛋白,一种新的参与细胞周期调控的功能蛋白
- 细胞周期是细胞生命活动的基本特征,细胞通过周期时相的变迁完成个体的发育和自我的更新。细胞周期的调控是决定各类细胞命运的关键,涉及Cyclin、CDK、CKI等多种调控因子的参与,它们相互协同作用组成一个庞大而复杂的调控网...
- 苏超宋娟Adiam Teche刘欣高星杰王鑫廷张桂敏赵虹杨洁
- 关键词：细胞周期
- 针对人Tudor-SN蛋白T103位点的应激磷酸化抗体制备及分析被引量：1
- 2014年
- 目的:针对人Tudor-SN蛋白T103位点(103位苏氨酸,Thr103)制备兔源多克隆磷酸化抗体,并进行应激磷酸化的时相分析。方法:首先人工合成含磷酸化T103(pT103)位点的多肽,4次免疫新西兰大白兔后获取抗血清;然后以AKTA蛋白纯化系统进行纯化,并利用Western blotting和细胞免疫荧光实验对纯化后的抗pT103抗体进行鉴定;最后以In-cell Western法进行Tudor-SN蛋白的应激磷酸化/去磷酸化时相性分析。结果:(1)确定并合成磷酸化多肽"TIENKpTPQGRC",收集约75 ml兔源抗血清,纯化后获取2.08 mg/ml抗pT103抗体;(2)当HeLa细胞受到氧化应激时,以pT103抗体检测的磷酸化信号增强,可在胞浆中检测到颗粒状信号,与内源性Tudor-SN应激颗粒存在共定位关系;(3)在氧化应激及应激去除后恢复过程中,T103位点的磷酸化水平呈现一定的波动性时相。结论:成功制备针对Tudor-SN蛋白T103位点的兔源多克隆抗pT103抗体,有助于从磷酸化修饰角度进行Tudor-SN在细胞应激方面的机制探讨。
- 高星杰张毅苏超付雪史雪彬尹洁何津岩王鑫廷姚智杨洁
- 关键词：磷酸化抗体
- Tudor-SN蛋白一级结构间断的SN5结构域质粒的拼接构建
- 2011年
- 目的 实现Tudor-SN蛋白TSN结构域内间断的SN5基因片段（SN5α、SN5β）的拼接以及与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中的融合表达.方法 利用Geno 3D对拼接的SN5进行结构预测.以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR分别扩增出SN5α和SN5β的基因,双酶切并纯化后,先将SN5β引入pEGFP-C2,完成重组质粒pEGFP-C2-SN5β,再将SN5α引入pEGFP-C2-SN5β,完成重组质粒pEGFP-C2-SN5.将pEGFP-C2-SN5β/ SN5脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况,Western印迹检测融合蛋白的表达.结果 ① 拼接的SN5结构预测显示与TSN完整结构中的SN5高度重合;②对重组质粒进行双酶切鉴定可见SN5α、SN5β、SN5的cDNA片段;③ 转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达;④ Western印迹后可在相应位置检测到融合蛋白.结论 pEGFP-C2-SN5/SN5β重组质粒构建成功,SN5α和SN5β在pEGFP-C2中实现了顺序拼接;目的片段可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达,融合蛋白可与抗GFP抗体结合用于蛋白检测.
- 钱宝鑫朱梦瑜高星杰刘欣苏超付晓王保亚王鑫廷杨洁
- 关键词：PEGFP-C2重组质粒
