目的克隆表达粉尘螨3类变应原(Der f 3)基因,并鉴定纯化蛋白的变应原性。方法取华南地区采集经实验室培养的粉尘螨(约500只)提取总RNA,经RT-PCR扩增Der f 3基因。将目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 3。大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养,表达Der f 3目的蛋白。重组rDer f 3蛋白经6His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,蛋白质印迹法(Western blotting)分析该纯化Der f 3蛋白与粉尘螨过敏患者血清IgE反应性,以鉴定重组Der f 3的变应原性。结果以粉尘螨总RNA为模板克隆出Der f3基因,该基因与GenBank (D63858)公布的Der f3比较有4个核苷酸差异,但同源性为99.5%。E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导后高效表达Der f 3重组蛋白,主要以包涵体形式存在。经Western blotting分析该重组蛋白Der f 3能与粉尘螨过敏患者血清的IgE反应,而不与健康者血清IgE反应。结论构建了华南地区粉尘螨3类变应原的原核表达载体,并高效表达和纯化出具变应原性的Der f3重组蛋白。
目的克隆表达我国深圳地区粉尘螨I类变应原Der f 1基因,并进行该基因的多态性分析和鉴定该纯化蛋白的变应原性,为研究具有我国区域特色的粉尘螨变应原奠定基础。方法从深圳地区挑取经形态鉴定的活粉尘螨,提取总RNA,RT-PCR扩增Der f 1基因,克隆到T载体测序确认。通过计算机软件进行该基因的多态性分析。将该目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 1。工程菌经IPTG诱导培养,表达Der f 1目的蛋白。重组Der f 1蛋白通过6 His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,并进行Western-Blot检测纯化的Der f 1蛋白与粉尘螨过敏病人血清中IgE的反应性,以鉴定重组Der f 1的变应原性。结果以粉尘螨总RNA为模板,经RT-PCR从深圳地区克隆了4株Der f 1基因。该基因与GenBank公布的Der f 1(No.AB034946.1)比较发现核苷酸的同源性在99.48%-100%之间,理论推导的氨基酸序列同源性在99.69%-100%之间。工程菌经IPTG诱导后高效表达的Der f 1重组蛋白,并主要以包涵体形式存在。Western-Blot试验证实该4株Der f 1基因表达的重组蛋白都具有变应原性。结论本研究克隆了4株深圳地区粉尘螨I类过敏原基因并实现了原核表达,为进一步开展Der f 1蛋白研究和重组变应原免疫治疗疫苗研究奠定基础。
