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利用目标基因捕获结合第二代测序技术发现腹主动脉瘤致病基因突变: 2015年; 目的建立目标基因捕获结合第二代测序技术对腹主动脉瘤患者原纤维蛋白1(FBN1)基因进行突变筛查,探讨腹主动脉瘤与FBN1基因突变的关系。方法提取4例腹主动脉瘤患者外周血全基因组DNA,利用Gen Cap目标基因捕获技术,设计FBN1的65个外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用Illumina Hi Seq2000第二代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger测序法对突变位点进行验证。结果设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。4例患者目标区域平均测序深度为448.15~536.61,99.5%~99.7%目标区域覆盖度。经过数据分析及Sanger测序验证发现1个新的错义突变c.2753 C>G(p.Pro918Arg),db SNP137数据库、千人基因组及内部800名正常汉族人数据库均无此突变。经SIFT预测为有害突变。结论本研究所建立的Gen Cap目标基因捕获技术结合Illumina Hi Seq2000第二代测序技术成功地发现了FBN1的新突变。该方法快速而有效,对腹主动脉瘤分子病因学有更好的认识。; 郭俊蔡伦李小燕王绿娅王绿娅; 关键词：腹主动脉瘤

组织蛋白酶S抑制剂对兔血管平滑肌细胞凋亡的影响: 2012年; 目的研究组织蛋白酶S抑制剂对培养的兔血管平滑肌细胞凋亡的影响及其机制。方法获取兔主动脉组织，传代培养血管平滑肌细胞，将细胞分为对照组、单药组（血管紧张素Ⅱ）、联合组（组织蛋白酶S抑制剂＋血管紧张素Ⅱ）；采用流式细胞术和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺II末端标记法（TUNEL）检测血管平滑肌细胞凋亡，蛋白质印迹法检测B细胞淋巴瘤基因．2蛋白、B细胞淋巴瘤基因-2相关蛋白X及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3的表达。结果①流式细胞术检查及TUNEL染色结果均显示，联合组血管平滑肌细胞晚期凋亡数量明显低于单药组；TUNEL染色10h和12h时点，单药组与联合组差异有统计学意义[10h：（23607±176）比（36058±269）个，12h：（29813±205）比（39146±263）个，均P〈0．05]；②蛋白质印迹检测结果显示，与单药组相比，联合组B细胞淋巴瘤基因－2相关蛋白X／B细胞淋巴瘤基因-2蛋白明显下降，组间差异有统计学意义（P〈0．05）；联合组半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶－3表达明显降低，组间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论组织蛋白酶S抑制剂可能通过下调B细胞淋巴瘤基因－2相关蛋白X、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3表达减轻血管平滑肌细胞凋亡。; 张耀中黄方炯秦彦文崔巍蔡伦王绿娅辛毅; 关键词：肌细胞平滑肌组织蛋白酶S 细胞凋亡

利用目标基因测序技术发现马方综合征FBN1新突变被引量：8: 2014年; 目的：建立目标基因捕获结合第二代测序技术,对马方综合征（Marfan syndrome,MFS）患者的原纤维蛋白-1（fibrillin-1,FBN1）基因进行突变筛查,探讨MFS与FBN1基因突变的关系.方法：提取5例MFS患者外周血全基因组DNA,利用GenCap目标基因捕获技术（北京迈基诺公司）,设计FBN1的65个外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用illumina hiseq2000第二代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,用Sanger测序法对突变位点进行验证.结果：设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段.5例患者目标区域平均测序深度为173.85 ～ 280.73,97.10％～ 98.00％目标区域＞4×覆盖度.经过数据分析及Sanger测序验证,发现1个新的无义突变c.5968 C＞T（p.Gln1990X）.结论：本研究所建立的GenCap目标基因捕获技术结合illumina hiseq2000第二代测序技术成功的发现了FBN1的新突变.该方法快速而有效,可以使我们对MFS分子病因学有更好的认识.; 郭俊蔡伦李小燕王绿娅杜杰; 关键词：马方综合征

CD8^+ T细胞在早期内毒素血症对心功能的损害作用被引量：5: 2012年; 目的:探讨CD8+T细胞在早期内毒素血症心脏损伤中的浸润及其对心功能的影响。方法:野生雄性小鼠20只随机分为野生对照组和野生内毒素血症组,每组各10只;CD8敲除雄性小鼠10只,随机分为CD8敲除对照组和CD8敲除内毒素血症组,每组各5只。对照组均给予0.9%氯化钠液腹腔注射,内毒素血症组均给予脂多糖腹腔注射。6 h显微超声检测射血分数及短轴缩短分数;即刻处死并收取野生对照组及野生内毒素血症组各3只小鼠心脏组织,流式细胞技术检测心脏细胞悬液中巨噬细胞(F4/80+细胞)及CD8+T细胞、CD4+T细胞分布;其余小鼠心脏组织进行病理切片HE染色,观察心肌纤维断裂及炎症细胞浸润。结果:与野生对照组相比,野生内毒素血症组射血分数及短轴缩短分数显著降低(均为P<0.05);野生内毒素血症组F4/80+细胞、CD4+T细胞及CD8+T细胞均显著增加(均为P<0.05)。与野生内毒素血症组相比,CD8基因敲除内毒素血症组射血分数及短轴缩短分数均显著升高(均为P<0.05)。结论:急性内毒素血症导致心肌纤维损伤、心功能不全,心脏组织CD8+T等炎症细胞浸润;而缺乏CD8+T细胞时则减轻内毒素血症导致的心功能损伤,提示CD8+T细胞在急性内毒素血症诱导的心功能不全早期发挥重要作用。; 屈超张晶蔡伦王绿娅杜杰; 关键词：内毒素血症脂多糖心功能 CD8+T细胞

熊胆粉联合环磷酰胺用药通过调控肿瘤微环境抑制结直肠癌肝转移作用的研究被引量：11: 2013年; 目的:探讨熊胆粉联合环磷酰胺(cyclophosphamide,cytoxan,CTX)用药通过调节肿瘤炎症微环境对小鼠结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)肝转移模型的增免抑瘤抗转移作用。方法:脾脏原位注射SL4细胞制作小鼠CRC肝转移模型。随机分5组:模型组、CTX组(80mg·kg-1)和CTX联合熊胆粉高、中、低剂量组(300,150,75mg·kg-1)。术后口服灌胃给药12d,于第13天取材,解剖肝脾称重,HE染色,免疫荧光分析;外周血、脾和肝转移瘤进行流式细胞免疫表型分析。结果:CTX组及CTX联合熊胆粉各组肝脾质量明显低于模型组(P<0.05);HE染色和免疫荧光分析表明,正常组织中淋巴细胞浸润较多,肿瘤组织周围有以巨噬细胞为主的大量炎细胞浸润;流式细胞检测结果表明:外周血中,联合治疗组与CTX组相比,T淋巴细胞显著升高(P<0.05),CD4/CD8增加;脾细胞悬液中,联合治疗组与CTX组比较,淋巴细胞总数增加,以B细胞增加较为显著(P<0.05),CD11b,F4/80细胞明显降低(P<0.05);肝转移瘤中,联合治疗后比单独CTX治疗单核巨噬细胞下降(P<0.05)。结论:熊胆粉联合CTX治疗不仅能保肝增免,还可通过调节肿瘤微环境,减少对单核巨噬细胞等的募集起到抗炎进而抗肿瘤转移作用,其中熊胆粉低剂量与CTX联合用药组降低炎症细胞浸润的作用最为显著。; 崔巍刘飒杨敏张婷蔡伦邱淑兰郑娇苗艳菊赵莉敏杜杰; 关键词：熊胆粉环磷酰胺结直肠癌肝转移肿瘤微环境

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术检测华法林代谢酶基因多态性被引量：3: 2014年; 目的用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术建立检测人群中华法林代谢酶基因多态性的方法。方法选取2011年1月至2013年1月北京安贞医院心脏外科心脏机械瓣膜置换术后接受华法林抗凝治疗的患者10例,采集外周血,提取全血基因组DNA,用MALDI-TOF-MS技术检测10例患者华法林代谢酶基因CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)、CYP2C9*6(rs9332131)、VKORC1 C>T(rs9923231)(-1639G>A)、GGCX G>C(rs11676382)的单核苷酸多态性(SNP)位点,并用Sanger测序法进行验证。结果用MALDI-TOF-MS技术可以同时完成10份标本3个华法林代谢酶基因5个SNP位点的检测。10名服华法林的心脏机械瓣膜置换术患者中,发现VKORC1-1639G>A AG型2例,AA型8例,A等位基因频率为90%。未发现CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)、CYP2C9*6(rs9332131)和GGCX G>C(rs11676382)突变。经与Sanger测序法比较,符合率为100%。结论成功建立MALDI-TOF-MS技术检测华法林代谢酶基因多态性的平台,该法具有高通量、快速、准确的特点,在个性化医疗上有较大的推广应用价值。; 郭俊李小燕蔡伦张魁董然王绿娅杜杰; 关键词：心脏机械瓣膜置换术华法林单核苷酸多态性

医学研究生"高通量测序技术"应用能力的培养: 2016年; 高通量测序技术目前已广泛的应用于临床研究领域。与传统测序方式相比,该技术具有通量高、耗时短、成本低等特点。研究生教育中对高通量测序技术的新进展及其在疾病研究、临床诊断等方面的应用方面的介绍较少。培养医学研究生对高通量测序技术的应用能力,可以增强研究生对高通量测序技术的方法、原理、应用范围、数据分析的理解,为医学研究生应用高通量测序技术发现及解决临床问题打下一定的基础。; 郭俊李小燕蔡伦王绿娅杜杰; 关键词：高通量测序医学研究生

目标基因捕获结合第2代测序技术检测原发性高血压致病基因突变: 2014年; 目的建立目标基因捕获结合第2代测序技术,对原发性高血压（EH）患者的13个已知致病基因进行突变筛查,探讨EH与致病基因突变的关系。方法提取5例EH患者外周血全基因组DNA,利用GenCap目标基因捕获技术,设计内皮素转化酶1（ECE1）、G蛋白调节信号5（RGS5）、钠钾三磷腺苷酶通道β1多肽（ATP1β1）、选择素E（SELE）、血管紧张素原（AGT）、血管紧张素受体1（AGTR1）、α-内收蛋白（ADD1）、细胞色素P450 3A亚家族多肽5（CYP3A5）、一氧化氮合酶3（NOS3）、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β3（GNβ3）、一氧化氮合酶2A（NOS2A）、苯基乙醇胺N-甲基转移酶（PNMT）和前列腺素I2合成酶（PTGIS）基因外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,将目标基因组区域的DNA片段进行富集后,再利用Illumina HiSeq 2000第2代测序仪进行测序,通过数据分析,确定突变位点,对选定的突变位点用Sanger测序法验证。结果设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。目标区域平均测序深度为301.12~431.92,99.30%~99.70%目标区域覆盖度。5例患者中ADD1基因发现3个错义突变;AGT基因发现1个错义突变;SELE基因发现2个错义突变;PNMT基因发现1个剪切位点突变;PTGIS基因发现1个错义突变。结论 GenCap目标基因捕获技术结合Illumina HiSeq 2000第2代测序技术成功发现了EH患者的致病基因突变。该方法快速有效,对深入研究EH的分子病因学有重要意义。; 郭俊蔡伦李小燕王绿娅杜杰; 关键词：原发性高血压致病基因

流式细胞术分析小鼠外周血免疫细胞全血裂解试剂比较研究被引量：3: 2011年; 本研究探讨流式细胞术外周血样本制备中红细胞裂解液的作用。用流式细胞术检测进口的商品化红细胞裂解液OptiLyse C(Beckman Coulter),FACS Lysing Solution(BD Pharmingen)以及自制裂解液RBC Lysis Buffer裂解小鼠外周血红细胞后免疫细胞的表达情况并进行了对比分析。结果表明,用3种裂解液制备样本中CD3e+、CD3e+CD4+、CD3e+CD8a+、CD3e-CD19+、CD3e-NK1.1+和Gr-1+细胞的百分比均无明显差异(p>0.05);而OptiLyse C裂解液更适于Gr-1+细胞测定,不适于Foxp3+Tregs细胞测定;FACS Lysing Solution和自制RBC LysisBuffer适于Foxp3+Tregs细胞测定。结论:应用自制RBC Lysis Buffer裂解液,按标准化操作程序制备流式样本,能够达到进口的商品化裂解液OptiLyse C的效果,它不仅能满足实验要求,又可降低试剂成本,可推广应用。; 崔巍刘飒蔡伦李玉琳张聪聪邱淑兰; 关键词：流式细胞术免疫细胞

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