刘卫超
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
- 供职机构：江南大学药学院更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金教育部“新世纪优秀人才支持计划”江苏省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学化学工程更多>>
- GST-His-Heparinase Ⅰ双标签融合蛋白的原核表达与纯化被引量：3
- 2014年
- 以pET15b-HepⅠ为模板,通过PCR技术扩增出上游合有6×His标签的HepⅠ基因序列,克隆至表达载体pGEX-4T-1。测序鉴定后,将重组表达质粒pGEX-His-HepⅠ转入E.coli BL21(DE3)感受态细菌,经IPTG诱导表达。表达产物可溶部分用GSTrap FF和HisTrap HP柱两步亲和纯化,所得产物经SDS-PAGE检测,在66 kDa和43 kDa处显示特异条带,分别与GST-His-HepⅠ和His-HepⅠ融合蛋白预期分子量相符;最终His-HepⅠ融合蛋白的比酶活为86.45 IU/mg,纯度高达99%,与仅一步亲和纯化得到的GST-His-HepⅠ融合蛋白相比,进一步提高了纯化后重组肝素酶的纯度。本研究为制备高纯度的HepⅠ提供了一种方法,对制备高安全性的LMwH和解析HepⅠ晶体结构具有重要意义。
- 刘卫超程咏梅邓超丁建文宋志新陈敬华
- 重组肝素酶Ⅰ热失活动力学模型的建立与应用
- 2014年
- 对组氨酸标签肝素酶I(His-Hep I,EC 4.2.2.7)的热失活机制进行了研究。针对短暂低温处理可以使热失活His-Hep I酶活部分恢复及添加二硫苏糖醇(DTr)使其热稳定性提高的现象,利用荧光探针法研究了失活过程His-Hep I构象变化,证明了该酶构象存在可逆转变行为。为进一步明晰His-Hep I的热失活机制,假设该酶热失活的主要途径包括去折叠及形成聚集体,并以此为基础建立模型进行拟合,模型与实验值吻合良好,表明假设的合理性。根据模型计算的活化能为E_r=100.217 kJ/mol、E_(ir)=7.857 kJ/mol和E_d=77.062 kJ/mol,此数据从一定程度上解释了冷处理为何能使His—Hep I部分恢复活性。进一步研究表明,任何能够抑制这两种途径发生的措施对于提高His-Hep I热稳定性都是有效的。
- 程咏梅陈潮梁陈敬华刘卫超周斌宋志新
- 关键词：热稳定性动力学数学模型
- 黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌培养条件的优化及高密度发酵被引量：1
- 2014年
- 黄杆菌肝素酶Ⅱ(HepⅡ)是一类可特异性切割肝素、硫酸乙酰肝素类分子内连接键的酶。文中对黄杆菌肝素酶Ⅱ重组菌的诱导时机、诱导剂添加量、诱导温度、诱导时间等诱导产酶条件进行优化。经过优化最佳摇瓶发酵产酶条件为:37℃培养重组菌至对数生长前期,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.3 g/L,20℃下诱导10 h,酶活达到最高,为570 U/L。在此基础上通过发酵罐高密度培养手段将菌体浓度OD600进一步提高到98,酶活大幅度提高到9 436 U/L,该研究结果为HepⅡ的工业化生产与应用奠定了良好的基础。
- 周斌程咏梅邓超刘卫超陈潮梁陈敬华许正宏
- 关键词：培养条件优化高密度发酵
