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强直性脊柱炎患者外周血中miR-17、miR-181、miR-106、miR-30和miR-495表达的分析被引量：14: 2014年; 目的:为了探讨microRNA在强直性脊柱炎患者发病过程中的作用,我们通过检测强直性脊柱炎患者外周血液中miR-17、miR-181、miR-106、miR-30和miR-495的表达情况,从而为研究microRNA在强直性脊柱炎发病机制中的调控作用和临床诊断价值提供新的思路。方法:收集强直性脊柱炎患者及正常人的外周血液,对外周血液中单个核细胞进行分离,并提取PBMC small RNA,用特异性茎环引物反转录成cDNA,并构建成熟的miR-17、miR-181、miR-106、miR-30和miR-495的T载体,制作标准曲线,利用stem-loop法通过Real-time PCR技术,检测miR-17、miR-181、miR-106、miR-30和miR-495的表达量。结果:本实验共收集临床样本92例,其中AS患者61例,正常人31例。通过Real-time PCR检测发现,与正常人相比,在强直性脊柱炎患者外周血中表达上调的有miR-106(P>0.05)与miR-30(P>0.05);表达下调的有miR-181(P<0.05)、miR-495(P<0.05)和miR-17(P>0.05),其中miR-181和miR-495有统计学意义。结论:与正常人相比在强直性脊柱炎患者外周血中miR-181和miR-495的表达量存在差异,它们可以靶向调控TLR-4,HLA-B,DVL和GSK/3β等基因,这一发现可能为强直性脊柱炎发病机制的研究提供新的思路,成为临床诊断中新的标志物。; 刘鑫魏军杨芝红周林林郑锡铭徐广贤; 关键词：MIRNA 强直性脊柱炎 REAL-TIME PCR

雷帕霉素对RAW264.7巨噬细胞10种与细胞自噬相关的miRNAs表达的影响被引量：3: 2014年; 目的:为了探讨雷帕霉素对RAW264.7细胞miR-30b、miR-200a和miR-17-5p等10种与细胞自噬相关的miRNAs表达水平的影响,为进一步研究miRNAs调控细胞自噬的机制提供理论依据。方法:雷帕霉素刺激RAW264.7巨噬细胞后,分别在2、4、6、8 h提取细胞small RNA,利用miRNA特异性的茎环引物反转录成cDNA,采用Real-Time PCR检测miR-30b、miR-30c、miR-106a、miR-214、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-17-5p、miR-142-3p、miR-377分子的表达情况。结果:雷帕霉素作用RAW264.7细胞后,miR-17-5p、miR-106在2、4、6 h表达上调(大于2.1倍P<0.05),miR-214在2、8小时表达上调(>2.4倍,P<0.05),miR-30b、miR-30c、miR-183、miR-200a、miR-376c、miR-142-3p在2、6、8 h表达上调(>2.4倍,P<0.05),而miR-183、miR-200a在4 h表达下调(>2.1倍,P<0.05),miR-30b在8小时则是显著性表达下调(大于50倍,P<0.05),miR-377在4 h则是表达上调(>2.5倍,P<0.05),但在2、8 h则是显著表达下调(>50倍,P<0.05)。结论:雷帕霉素刺激RAW264.7巨噬细胞后miR-200a、miR-30b、miR-377、miR-30c、miR-376c、miR-17-5p有显著性变化,说明这些miRNAs可能通过调控某些自噬相关基因在细胞自噬过程中发挥着重要作用。; 张涛郑锡铭周林林刘鑫赵瑾徐广贤; 关键词：MIRNA 雷帕霉素 REAL-TIME

miR-638慢病毒载体的构建及其对MAPK14的靶向调控作用被引量：13: 2014年; 目的构建miR-638慢病毒过表达载体,探讨其对MAPK14基因的靶向调控作用。方法分别构建pSicoR-miR-638及pMIR-Report-MAPK14过表达载体,应用双荧光素酶报告基因活性、Western blot及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法验证miR-638与MAPK14的靶向调控关系。结果经PCR、酶切及测序结果证明成功构建了pSicoR-miR-638及pMIR-ReportMAPK14重组质粒,并通过实验证实miR-638过表达明能显抑制MAPK14的蛋白及mRNA表达(P<0.05);抑制miR-638的表达,则MAPK14蛋白及mRNA的表达水平明显上调(P<0.05)。结论成功构建pSicoR-miR-638慢病毒载体,并证实其可通过靶向作用于MAPK14-3’UTR的特异序列而直接抑制MAPK14基因的表达。; 邢译文刘鑫周林林白静范维宁徐广贤; 关键词：MICRORNA

OPN siRNA慢病毒载体的构建及其对大肠癌细胞增殖的抑制作用被引量：4: 2014年; 目的构建OPN-siRNA的慢病毒载体,探讨其对结肠癌SW480细胞增殖的调节作用。方法设计合成针对OPN的siRNA序列,退火形成双链DNA并克隆到pSicoR质粒后,包装重组慢病毒。应用Real-time PCR及Western blot检测病毒刺激SW480细胞后OPN的mRNA和蛋白的表达水平,应用MTT法检测慢病毒对SW480细胞增殖的调节作用。结果成功构建了携带OPN-siRNA的重组慢病毒。该重组慢病毒可使SW480细胞内OPN的mRNA和蛋白的表达降低,LV-siRNA-OPN慢病毒对SW480细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05)。结论成功构建的LVsiRNA-OPN慢病毒可以有效抑制SW480细胞内OPN的mRNA和蛋白表达,并抑制SW480细胞的增殖。; 邢译文白静范维宁刘鑫周林林徐广贤; 关键词：OPN SIRNA 慢病毒 SW480细胞

6种miRNAs在类风湿关节炎患者外周血及关节液中的表达分析被引量：14: 2014年; 目的:探讨miR-16、miR-17、miR-30a等6种miRNAs在类风湿关节炎(RA)患者外周血血浆、单个核细胞(PBMC)及关节液中的表达水平及其临床意义,为进一步研究其在RA中的作用机制提供理论依据。方法:收集80例RA患者、32例骨关节炎(OA)患者及32例健康人外周血、关节液,分离血浆及PBMC;提取small RNA,用特异性茎环引物反转录成c DNA,构建成熟miRNAs的T载体,绘制标准曲线;stem-loop法Real-time PCR检测血浆、PBMC及关节液miRNAs的表达量,进行相关性分析;并与RA活动性监测指标类风湿因子(RF)、血沉(ESR)、C-反应蛋白(CRP)进行相关性分析。结果:RA组血浆、PBMC和关节液中miR-16、miR-17、miR-30a、miR-106 miR-101和miR-130相对于OA组、健康对照组表达上调(P<0.05),但血浆中miR-101的表达水平与OA组差异无统计学意义。相关性分析显示,6种miRNAs在血浆、PBMC及关节液中有不同程度的正相关(P<0.05)。与RF、ESR、CRP相关分析显示,血浆、PBMC和关节液中miRNAs与一个或多个指标正相关(P<0.05)。结论:miR-16、miR-17、miR-30a、miR-101、miR-106、miR-130在RA患者血浆、PBMC及关节液中有显著变化,表明这些miRNAs可能通过调控某些相关基因在RA的发病过程中发挥重要作用;其表达水平可作为RA疾病活动的有效检测指标,为RA提供新的诊断标志物。; 郑锡铭刘鑫周林林张涛张爱君徐广贤; 关键词：MIRNA 类风湿关节炎 REAL-TIME PCR

miR-508-5P慢病毒过表达载体的构建及对S期激酶相关蛋白2靶向调控作用: 2014年; 目的构建miR-508-5p慢病毒过表达载体,探讨其对SKP2基因的靶向调控作用。方法基于化学法合成miR-508-5p茎环结构RNA,将其克隆入线性化的pSicoR质粒中,经双酶切及测序鉴定,将阳性重组体转染至HEK293T细胞;同时构建与miR-508-5p互补靶基因SKP2的3'非翻译区(3'UTR),将其克隆入线性化的pMIR-Report载体中。通过相对荧光素酶活性、Western blot法及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法验证miR-508-5p与SKP2 3'UTR的靶向调控关系。结果经PCR、酶切及测序结果证明成功构建了pSicoR-miR-508-5p及pMIR-Report-SKP2-3'UTR重组质粒,并通过实验证实miR-508-5p过表达明显抑制SKP2的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P<0.05);抑制miR-508-5p的表达,则明显上调SKP2的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P<0.05)。结论成功构建pSicoR-miR-508-5p慢病毒过表达载体,证实通过靶向作用于SKP2-3'UTR的特异序列直接抑制SKP2基因的表达。; 白静邢译文范维宁郭乐刘鑫郑锡铭徐广贤; 关键词：MICRORNA S期激酶相关蛋白2

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刘鑫

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