廖四芳
- 作品数：10 被引量：4H指数：1
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- 相关领域：生物学更多>>
- 心脏发育候选基因PYGO1 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定
- 2012年
- 利用RNA干扰技术构建PYGO1基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒(pSUPER-PYGO1)。首先,针对PYGO1 cDNA序列设计并化学合成一对编码短发夹RNA序列,经退火插入到由BglⅡ和XhoⅠ酶切的pSU-PER质粒上构建重组RNAi质粒pSUPER-PYGO1。通过XbaⅠ酶切鉴定及测序分析验证构建效果,将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞系H9c2建立产生逆转录病毒的细胞克隆。通过RT-PCR和Western blot检测pSU-PER-PYGO1对H9c2细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白的干扰效果。pSUPER-PYGO1质粒经酶切鉴定及测序分析,发现59nt寡核苷酸成功插入到预计位点,且序列完全一致;RT-PCR和Western blot检测结果显示转染pSUPER-PYGO1的细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白量明显降低。因此,靶向PYGO1的pSUPER RNAi载体构建成功,为进一步从分子水平探讨PYGO1在心脏发育中的功能奠定了基础。
- 刘明刘宪楚周军媚谢华平廖四芳宋文李佑锋吴秀山王跃群
- 关键词：RNA干扰PSUPERH9C2
- 斑马鱼心脏标记基因VMHC多抗血清的制备被引量：2
- 2011年
- 斑马鱼基因VMHC(Ventricular myosin heavy chain)是心脏发育早期的标志基因,制备该基因多抗血清,首先通过生物信息学方法,选择VMHC基因中特异性强、具亲水性的一段核苷酸序列(3 772～4 221 bp),通过PCR扩增,将片段重组到原核表达载体pGEX-4T-1,通过原核诱导表达获得含有表达目的片段的融合蛋白,以该融合蛋白免疫小鼠,获得VMHC多克隆抗鼠血清.对该多抗血清抗体进行验证,结果具有很好特异性和较高效价,可以用作western-blot、免疫印迹等试验分析.
- 王琨满贤刘华友李志李发祥赵阳廖四芳吴秀山袁婺洲
- 关键词：标记基因融合蛋白
- 果蝇Domeless蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究
- 2013年
- 在果蝇(Drosophila melanogaster)的研究中发现Domeless接受器参与发育期间的JAK/STAT信号调节,在心脏疾病的发生机制中发挥重要作用.为了克隆Domeless,我们利用生物信息学选择果蝇Domeless基因抗原亲水区,将扩增出的PCR片段克隆到原核表达pET-28a载体中,转入E.coli(Escherichia coli)中后通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactoside)诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-Domeless融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.用Western blot检测抗体的效价和特异性.获得了Domeless原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Domeless多克隆抗体,为后续Domeless功能研究奠定了基础.
- 唐超任恋刘宪楚李容江志钢赵阳廖四芳袁佳佳莫小阳吴秀山
- 关键词：果蝇原核表达多克隆抗体
- 人类成肌发育候选基因ASB12 RNAi稳定细胞系的构建与鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的:利用siRNA表达载体构建抑制人类成肌发育候选基因ASB12表达的pSUPER RNAi载体(pSU-PER-ASB12),筛选构建C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系。方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向成肌发育候选基因ASB12的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、XhoⅠ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER-ASB12)。通过酶切鉴定及测序分析检测构建效果。将正确构建的质粒转染小鼠骨骼肌细胞C2C12,通过G418筛选,免疫荧光检测,RT-PCR分析,建立稳定表达pSUPER-ASB12的细胞系C2C12-pSUPER-ASB12。结果:pSUPER-ASB12载体经酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系可表达绿色荧光蛋白,RT-PCR检测结果显示C2C12-pSUPER-ASB12细胞中ASB12表达量明显降低。结论:靶向ASB12的pSUPER RNAi载体和C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系构建成功,为进一步从分子水平探讨ASB12在成肌发育中的功能奠定了基础。
- 文斗斗周军媚廖四芳宋文胡维新吴秀山王跃群
- 关键词：PSUPERRNAI
- Smyd1干扰真核表达质粒及其稳定转染H9c2细胞系的构建
- 2011年
- 运用RNA干扰技术(RNA interference RNAi)构建pSUPER.retro-Smyd1真核表达质粒,经鉴定后用脂质体法转染H9c2细胞,通过G418筛选出稳定表达pSUPER.retro-Smyd1的细胞系,最后经Western blot及RT-PCR实验鉴定其干扰效果。经鉴定,通过H9c2细胞系构建的pSUPER.retro-Smyd1干扰细胞系的干扰效果显著。因此,本实验成功构建了Smyd1干扰真核表达质粒及其稳定转染的H9c2细胞系,为进一步研究Smyd1基因在心脏发育中的作用奠定了良好的实验基础。
- 李帆廖四芳刘华友鲁建鑫刘宪楚刘明吴秀山李永青
- 关键词：RNAI技术SIRNA稳定转染
- 稳定过表达人KLHL31基因的H9c2细胞系的建立及鉴定被引量：1
- 2011年
- 人类KLHL31基因是本实验室已克隆的基因,其蛋白质含有保守的BTB和串连重复的Kelch结构域,实验表明人类KLHL31在成体骨骼肌和心肌组织中特异表达,KLHL31蛋白的过表达可以抑制了AP-1与SRE的活性。本文拟利用阳离子聚合物转染技术将重组表达质粒pCMV-tag2B-KLHL31转染H9c2细胞,通过G418筛选,RT-PCR和Western blotting验证,建立稳定过表达KLHL31基因的细胞系H9c2-KLHL31,为研究KLHL31在心脏发育及其相关功能提供有用的细胞研究模型。
- 周军媚叶湘漓廖四芳刘明吴秀山王跃群
- 关键词：MAPKH9C2稳定细胞系
- 抗果蝇MRJ蛋白单克隆抗体的制备和鉴定
- 2013年
- 制备抗果蝇MRJ蛋白单克隆抗体可用于研究果蝇mrj的生物学功能,使用IPTG诱导重组质粒pET28a-mrj在大肠杆菌Rosetta中表达,重组蛋白经过Ni-IDA凝胶柱亲和纯化后免疫BALB/c小鼠。然后取免疫好的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经克隆和筛选获得了能分泌抗果蝇MRJ蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。腹水制备后获得单克隆抗体,通过ELISA和Western Blot对所获得的抗体进行鉴定,结果表明所制备单克隆抗体能够特异性结合于原核及真核细胞表达的MRJ蛋白,可用于研究mrj基因的生物学功能。
- 廖四芳刘丹宋文刘明赵阳唐超吴秀山王跃群
- 关键词：细胞融合单克隆抗体
- 利用TALEN打靶技术建立果蝇心脏发育候选基因Yippee突变品系
- 2013年
- 研究工作者们一直致力于寻找一种在模式生物中进行精确基因修饰的方法。近期基于TALENs的基因打靶方法受到广泛的注意,并在包括果蝇、斑马鱼、小鼠及人类多潜能细胞的多物种中取得成功。在这里,我主要介绍基于TALENs的基因修饰在果蝇模型中的应用以及果蝇心脏发育候选基因Yippee的敲除。首先,我们设计并拼接好了Yippee基因的TALENs靶位点序列,连接在核酸酶Xmn I的催化区域。在核酸酶的作用下产生双链的断裂,随后在非同源末端连接物修复系统(NHEJ)的修复下导致Yippee基因的消除或部分缺失。经过检测,得到Yippee基因的TALENs打靶效率约为9%。
- 蔡哲彦万永奇唐旻曾群朱莎莎廖四芳吴秀山袁婺洲
- 关键词：果蝇基因打靶
- 斑马鱼HLRA基因调控心脏左右不对称的发育
- 在胚胎发育过程中左右不对称发育对于心脏的环化、瓣膜形成和房室分隔等都非常重要,左右不对称的缺陷会引起错位导致的各种器官功能上的异常.我们发现HLRA基因可能与左右不对称发育有关.以斑马鱼为模型,通过对HLRA的表达研究发...
- 谢华平叶湘漓刘明廖四芳宋文袁佳佳吴秀山王跃群
- 果蝇血液发育基因Nfat的多克隆抗体的制备
- 2012年
- Nfat基因在血液发育中具有重要作用.根据已报道的Nfat基因序列,以果蝇胚胎cDNA为模板,通过PCR扩增Nfat部分编码序列,并将其连接到pET-28A原核表达载体上,经过双酶切以及测序鉴定成功后,将重组质粒转化E.coli BL2l.在37℃时,通过IPTG诱导表达融合蛋白,通过尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,然后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blotting检测抗体的效价以及特异性.结果表明,获得的Nfat多克隆抗体特异性较强,为后期Nfat基因的研究工作奠定了基础.
- 杨哲雷旻音廖四芳王跃群吴秀山
- 关键词：NFAT果蝇融合蛋白多克隆抗体
