祝畅
- 作品数：18 被引量：28H指数：2
- 供职机构：华中科技大学同济医学院附属同济医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 局灶性脑缺血大鼠永生化神经前体细胞移植的可行性被引量：2
- 2006年
- 目的:观察局灶性脑缺血大鼠移植永生化神经前体细胞在脑内的存活情况,为进一步研究细胞移植及转基因治疗脑缺血提供有意义的数据及图像资料。方法:实验于2005-10/2006-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学实验室进行。①选取健康雄性SD大鼠18只,随机数字表法分为假手术组、脑缺血对照组、细胞移植组,6只/组。②脑缺血对照组、细胞移植组采用线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉缺血模型。假手术组仅分离血管,不进行脑缺血处理。③应用无血清Neurobasal培养基进行INPC培养,移植前加入BrdU,使终浓度为10μmol/L,标记3d,然后取出细胞爬片,无水甲醇固定10min,SP法检测BrdU标记细胞阳性率。④将BrdU标记3d的永生化神经前体细胞用胰蛋白酶消化,离心重悬后使细胞密度达到2×1010L-1,细胞移植组于大鼠脑缺血后3d取5μL永生化神经前体细胞移植到右侧纹状体缺血半暗带区,以前囟为零点,即A:-0.5mm,R:2.5mm,V:-4.5mm。脑缺血对照组仅注射等量磷酸盐缓冲液。⑤各组分别于缺血后6h,1d,3d及细胞移植后1周对大鼠进行Longa神经功能评价(0～4分,分数越高表示神经功能损伤越严重),缺血后6h神经功能评分≥1分视为模型成功。⑥细胞移植后1周处死各组大鼠,取脑组织制作冰冻切片,通过免疫组织化学SP法检测BrdU的表达,观察移植的永生化神经前体细胞在脑内缺血半暗带区的存活情况。结果:18只大鼠均进入结果分析。①体外检测移植细胞BrdU标记阳性率:永生化神经前体细胞加入BrdU标记3d后,免疫组化检测阳性细胞胞核呈棕黄色,细胞阳性率达95%以上。②造模后不同时间点各组大鼠神经功能评价:缺血后6h,脑缺血对照组与细胞移植组每只大鼠神经功能Longa评分均≥1分,表明造模成功,且Longa评分均明显高于假手术组[(1.70±0.48)分,(1.60±0.52)分,0分,P<0.05]。缺血后6h,1d,3d及细胞移植后1�
- 姚文龙张传汉钱巍祝畅桂伶俐刘志恒
- 关键词：干细胞脑缺血
- 永生化神经前体细胞治疗大鼠局灶性脑缺血的实验研究
- 2008年
- 目的探讨永生化神经前体细胞（INPC）移植对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响及移植细胞在模型大鼠脑内的存活以及分化情况。方法雄性sD大鼠24只，均采用线栓法建立大脑中动脉缺血（MCAO）模型，随机分为2组（每组12只）：脑缺血对照组、INPC移植组。缺血后3d通过立体定位注射方法分别将等体积的磷酸盐缓冲液、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记的INPC悬液注射到2组大鼠纹状体缺血半暗带区。缺血再灌注后对大鼠进行神经损害严重程度评分（NSS）。细胞移植后1和4周分别随机处死2组大鼠各6只，取脑组织制作冰冻切片，通过免疫荧光双标技术检测BrdU、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）双阳性细胞和BrdU、神经元特异性烯醇化酶（NSE）双阳性细胞，观察INPC在移植区域的存活及分化情况。结果脑缺血对照组与INPC移植组比较，细胞移植前后各时点的NSS评分差异均无统计学意义（均P〉0．05）。INPC移植组细胞移植后1及4周，均可在移植针道附近及缺血灶周围检测到聚集较明显的BrdU免疫荧光染色阳性的植入细胞，并观察到BrdU染色阳性细胞扩散至全脑，免疫荧光双标技术检测见部分细胞为BrdU、GFAP双阳性的星形胶质细胞或BrdU、NSE双阳性神经元。结论INPC可在局灶性脑缺血大鼠脑内存活并分化为神经元和星形胶质细胞。
- 钱巍姚文龙祝畅柳璐桂伶俐刘志恒张传汉
- 关键词：抗原干细胞脑缺血
- 不同核因子κB二聚体对永生化神经前体细胞存活的影响
- 2008年
- 目的探讨不同核因子κB（NF-κB）二聚体在缺氧缺糖条件下对永生化神经前体细胞（INPC）生存的影响。方法将含巨细胞病毒启动子的对照载体（RC／CMV）及NF-κB亚基p50、p65的真核表达载体RcCMV-p50、RcCMV-p65分别及共转染INPC。蛋白质印迹法分析不同细胞株p50及p65的表达。凝胶电泳迁移实验（EMSA）检测胞核内NF-κB的DNA结合活性。蛋白质印迹法分析胞质蛋白IκBα的表达。缺氧缺糖13h后，噻唑蓝（M丌）法测定细胞存活率。结果转基因后，共得到5株不同细胞，分别命名为INPC、INPC／CMV、INPC／p50、INPC／p65和INPC／p50p65。蛋白质印迹分析显示，p50和p65基因均能在转染相应质粒的细胞株中高效表达。EMSA表明，INPC／p50、INPC／p65和INPC／p50p65细胞胞核中分别形成p50同源二聚体、p65同源二聚体、p50p65异源二聚体和p50同源二聚体。INPC／p65和INPC／p50p65细胞株中，IκBα在胞质中表达明显升高，并且缺氧缺糖处理13h后，细胞存活率显著低于其他细胞株（Games-Howell检验，均P〈0．05）。结论p50、p65的高表达可直接导致胞核内不同NF-κB二聚体DNA结合活性的升高。在神经前体细胞中，具有转录活性的NF-κB二聚体减少了缺氧缺糖刺激后细胞的存活，但无转录活性的NF-κB二聚体并未发挥保护性作用。
- 桂伶俐张传汉刘志恒陈钊军祝畅
- 关键词：细胞存活神经前体细胞
- 电凝法与线栓法制备大脑中动脉缺血模型在脑卒中后中枢痛研究中的应用对比
- 2024年
- 目的采用电凝法与线栓法分别造成小鼠大脑中动脉缺血,建立脑卒中后中枢痛(central post-stroke pain,CPSP)模型,探究更贴近临床的造模方法。方法选择6~8周龄(20~25g)健康雄性C57BL/6小鼠,随机分为空白对照组(Naive组)、电凝组(dMCAO组)和线栓组(tMCAO组),进行不同造模处理。在造模后行Longa神经功能缺陷评分,利用TTC染色评估大脑梗死体积,通过机械性缩足阈值和热缩足潜伏期评估小鼠的疼痛状态,旷场实验评估小鼠的运动功能。结果与Naive组相比,电凝组和线栓组小鼠造模后神经功能缺陷评分均升高(均P<0.01),TTC染色可观察到不同程度的脑缺血(P<0.05,P<0.01);与Naive组相比,电凝组和线栓组在造模后的第7、14、21、28天均表现出机械性痛觉超敏和热痛觉过敏,两组差异无统计学意义;与Naive组相比,电凝组小鼠在造模后第29天的运动功能无显著差异,而线栓组小鼠的运动功能下降(P<0.01)。结论电凝法和线栓法均可诱发脑卒中后中枢痛,但电凝法更贴近CPSP的临床表征,更具复制意义。
- 汲晓宇刘彤彤张传汉祝畅张玥
- 关键词：动物模型神经病理性疼痛大脑中动脉栓塞脑缺血
- IκBα突变型基因对缺氧缺糖损伤永生化神经前体细胞的保护作用
- 2008年
- 目的:检测在缺氧缺糖环境中,IκBα突变型基因对永生化神经前体细胞株(INPCs)NFκ-B的活性、细胞存活及细胞损伤的影响.方法:在建立转染pcDNA3.1及转染pcD-NA3.1/IκBαM INPCs的基础上,用MTT法检测缺氧缺糖处理3,6和9 h后两细胞株的存活率,用荧光素酶报告基因检测两细胞株缺氧缺糖6 h前后NFκ-B的活性,并测定缺氧缺糖6 h处理后培养液中乳酸脱氢酶的含量,用Hoechst33342染色观察细胞核的形态.结果:转染pcDNA3.1/κIBαM的INPCs中NFκ-B的活性均低于转染pcDNA3.1的INPCs,缺氧缺糖6 h或9 h时,前者存活率高于后者,且6 h时前者上清中的乳酸脱氢酶释放量较少,缺氧缺糖可使两细胞株的部分细胞核呈现凋亡改变.结论:κIBα突变型基因可降低INPCs中NFκ-B的活性,提高INPCs在缺氧缺糖处理后的存活率,减轻细胞损伤.
- 祝畅刘志恒张传汉桂伶俐姚文龙
- 关键词：干细胞细胞缺氧
- 大鼠永生化神经前体细胞CDH1小干扰RNA真核载体的构建被引量：1
- 2008年
- 目的构建大鼠永生化神经前体细胞（INPC）CDH1小干扰RNA（siRNA）真核载体。方法根据大鼠CDH1基因的编码序列设计3个小发夹RNA（shRNA）干扰序列及1个阴性对照序列，根据pENTR／H1／TO中间载体说明书设计并合成相应的DNA单链，退火后分别连接到pENTR／H1／TO线性载体上，形成完整载体，提取CDH1 siRNA真核载体后（分别为CDH1 siRNA1、CDH1 siRNA2、CDH1 siRNA3和CDH1 siRNA对照），进行DNA测序鉴定。采用Lipofectamine 2000法，分别将成功构建的CDH1 siRNA真核载体转染大鼠INPC，于转染24h和48h时计算INPC转染效率=INPC成功转染数／细胞总数，于转染48h时提取细胞总RNA，采用实时定量PCR法检测INPC CDH1 mRNA的表达。结果经DNA测序鉴定构建的3个CDH1 siRNA真核载体和1个阴性对照载体所插入的RNA干扰序列均正确，无碱基突变或缺失；INPC转染24h与48h时转染效率分别为（54±5）％和（36±4）％；CDH1 sinNA2转染INPC 48h时INPC CDH1 mRNA表达水平较CDH1 siRNA3降低，且两者均低于CDH1 siRNA1（P〈0．05）。结论本研究成功构建大鼠INPC CDH1 siRNA真核载体。
- 姚文龙张传汉柳璐祝畅邱瑾桂伶俐田玉科
- 关键词：干细胞
- 人胚神经干细胞的长期贴壁培养和鉴定被引量：15
- 2006年
- 目的:探讨人胚神经干细胞的长期贴壁培养条件及传代方法。方法:在多种培养条件下,分别从9周和16周人胚脑中分离培养神经干细胞,应用免疫细胞化学的方法对所分离细胞的巢蛋白表达、自我更新能力和多向分化潜能进行鉴定。结果:采用高密度悬浮培养法能有效地从两种胚龄的人胚脑或室管膜下区中分离出神经干细胞,而采用贴壁培养法的人胚神经干细胞能保持干细胞的特性稳定增殖4个月。结论:从大小胚龄的人胚中均可成功分离培养人胚神经干细胞,贴壁培养的人胚神经干细胞能稳定增殖,是进一步进行人胚神经干细胞转基因研究的良好模型。
- 祝畅张传汉刘志恒桂伶俐高峰
- 关键词：人胚胎神经干细胞细胞培养
- 转IκBα突变型基因永生化神经前体细胞株的构建被引量：2
- 2006年
- 目的掏建转IΚBα突变型基因水生化神经前体细胞抹(INPCs)。方法限制性内切酶双酶切含IΚBα突变型基因的质粒pBluescript/CNP/IΚBαM,得到目的基因片断IΚBα突变型基因,克隆入真核表达载体pcDNA3．1中,酶切反应及DNA测序鉴定莆组载体pcDNA3．1/IΚBαM。利用脂质体介导的基因转染技术分别将载体pcDNA3．1及pcDNA3．1/IΚBαM转染INPCs．经G418(150μg/ml)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养．2周后用RT-PCR和Western blot检测阳性细胞株中IΚBα的表达,用受NF-ΚB特异性启动表达的荧光素酶报告基因检测阳性细胞株中NF-κB的活性。结果经限制性酶切分析及DNA测序证实重组载体pcDNA3．1/IκBαM中含有IκBα突变型基因．转pcDNA3．1/IκBαM永生化神经前体细胞中IκBα的总mRNA表达增高,Western blot可检测到突变型IκBα蛋白的表达,且细胞中NF-κB活性下降。结论成功构建了,转IκBα突变型基因INPCs。
- 刘志恒祝畅桂伶俐姚文龙张传汉
- 关键词：神经元基因表达
- GFAP特异性启动IκBα突变型基因真核表达载体的构建和鉴定被引量：1
- 2007年
- 目的构建GFAP特异性启动的、能稳定表达IκBα突变型基因的真核表达载体。方法用基因工程的方法将潮霉素抗性基因和GFAP特异性启动的IκBα突变型基因定向克隆入载体pBluescript-SK中,酶切反应鉴定重组载体SK-hyg和SK-hyg-GFAP/IκBαM。用脂质体法分别将载体SK-hyg和SK-hyg-GFAP/IκBαM转入永生化星形胶质细胞株和PC12细胞株中,经潮霉素(150μg/mL)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养,Westernblot检测阳性细胞株中IκBα的表达,以NF-κB特异性启动表达的荧光素酶报告基因检测细胞中NF-κB的活性。结果限制性酶切分析证实重组载体成功,稳定转染SK-hyg和SK-hyg-GFAP/IκBαM的PC12细胞内IκBα蛋白质表达及细胞中NF-κB活性无差异,稳定转染SK-hyg-GFAP/IκBαM的永生化星形胶质细胞内有突变型IκBα的蛋白质表达,而转染SK-hyg的永生化星形胶质细胞内则没有,且前者细胞内NF-κB活性下降。结论GFAP特异性启动的、能稳定表达IκBα突变型基因的真核表达载体构建成功。
- 祝畅刘志恒张传汉姚文龙桂伶俐
- 关键词：启动子胶原纤维酸性蛋白IKBΑ
- NF—κB在永生化神经前体细胞凋亡中的作用
- 2010年
- 目的探讨NF-κB在永生化神经前体细胞凋亡中的作用。方法永生化神经前体细胞接种于6孔板，随机分为5组，每组6孔，INPC组不进行基因转染，INPC／CMV组转染表达质粒RcCMV；INPC／050组、INPC／p65组分别转染含050基因和p65基因的表达质粒RcCMV，转染后2d，加入200μg／ml G418筛选12～14d，进行阳性克隆扩大培养3—4周，检测050mRNA、p65mRNA表达、NF-κB活性和细胞凋亡情况。INPC／p50#5组转染含p65基因的表达质粒RcCMV，加入200μg／mlG418筛选12—14d，进行阳性克隆扩大培养3～4周，转染含pSO基因的表达质粒RcCMV，2d后进行上述指标的检测。结果INPC／050组和INPC／p50#5组p50mRNA表达高于其他组（P〈0．05），INPC／p65组和INPC／p50p65组p65mRNA表达、NF-κB活性及细胞凋亡率高于其他组（P〈0．05）。结论NF-κB活性升高可促讲永牛化神绎前体细胞的凋产．
- 刘志恒桂伶俐祝畅姚文龙张传汉
- 关键词：NF-ΚB干细胞
