对乳酸杆菌pPG质粒表达系统理想表达条件进行了探索。以干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393为宿主菌,β-葡萄糖苷酸酶(gusA)基因作为表达的报告基因,根据干酪乳杆菌的生长特性对细胞表面表达载体pPG表达过程中各个关键因素的影响进行了探索。得出最佳表达条件:将其培养于质量浓度为1%乳糖,初始pH值在6.0～6.5之间的MRS培养基中,30～32℃,静止培养至A590OD达0.5,培养时间约8 h,表达效率最高,外源蛋白的表达量可占菌体总蛋白的14%。
将编码猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2基因插入干酪乳杆菌细胞表面表达载体pPG中,构建了重组表达载体pPG-VP2,将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393,获得了表达猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌系统,经2%乳糖在MRS培养基中的诱导表达,SDS-PAGE检测表明,有约74kD蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western-blot结果分析表明,表达的蛋白可被鼠源PPV抗血清所识别,间接免疫荧光实验结果表明,所表达的蛋白能够在干酪乳杆菌菌体表面检测到。
【目的】构建产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C. perfringens)α毒素基因的重组干酪乳杆菌口服疫苗,为产气荚膜梭菌毒素中毒的防治提供有效方法。【方法】将构建的重组产气荚膜梭菌α毒素基因细胞表面型载体pPG1及分泌表达载体pPG2电转化乳酸乳杆菌(Lactobacillus casei L.casei),获得阳性重组菌pPG1-α/L.casei393乳酸乳杆菌表面表达系统和pPG2-α/L.casei 393乳酸乳杆菌分泌表达系统。重组菌以1%乳糖为诱导物,在MRS培养基中进行诱导,通过Western-blot和间接免疫荧光方法鉴定,确定目的蛋白的表达。将重组菌口服免疫BALB/c小鼠,收集免疫小鼠粪便及眼冲洗液及外生殖道黏液样本测定小鼠产生抗α毒素的特异性sIgA抗体水平,采集小鼠血液样本测定血清中抗α毒素的特异性IgG抗体水平。并对免疫小鼠进行α毒素的腹腔攻毒试验及对获得的抗血清进行α毒素中和试验测定。【结果】重组干酪乳杆菌pPG1-α/L. casei 393及pPG2-/L. casei 393免疫小鼠能够产生明显的抗α毒素的sIgA和IgG抗体水平,其对α毒素中和试验结果为完全保护。腹腔攻毒实验结果为能抵抗3倍最小致死剂量(minimum lethal dose,MLD100)的α毒素攻击。【结论】表达产气荚膜梭菌α毒素免疫保护性抗原的重组乳酸乳杆菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答和免疫中和效力。
