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空肠弯曲菌flaa—PCR—RFLP分子检测技术的初步应用被引量：3: 2009年; 空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是导致细菌性肠炎的常见病原菌，作为食源性病原菌，主要是由于食用了被污染的食物、水等而感染，建立快速、准确的分子亚分型方法对于追踪污染来源和监控暴发流行具有重要意义。PCR-RFLP（PCR restriction fragment length polymorphism）是针对单基因的一种亚分型方法，能够在短时间内对大量菌株进行调查研究，不需要特殊设备，普通临床实验室即可开展，已被应用于多种人兽共患病原菌的流行病学监测和溯源性分析。本研究选择空肠弯曲菌鞭毛基因，应用限制性内切酶Dde Ⅰ，建立针对空肠弯曲菌的flaA—PCR-RFLP方法，并对来源于腹泻病人和鸡的280株空肠弯曲菌分离株进行分子亚分型研究分析。; 黄金林许海燕尹衍新张弓潘志明刘秀梵焦新安; 关键词：空肠弯曲菌分子检测技术常见病原菌食源性病原菌流行病学监测

人C-Met胞外区慢病毒穿梭载体构建及在293T细胞中的表达被引量：3: 2015年; 本研究构建含人肝细胞生长因子受体(C-Met)胞外区基因的慢病毒表达载体,并将其转染293T细胞,真核表达并纯化获得人C-Met胞外段蛋白。采用RT-PCR扩增人C-Met胞外区(ED)基因,构建慢病毒表达载体p RRL-CMV-ED,磷酸钙法转染293T细胞,RT-PCR及Western blot法检测ED基因在293T细胞中mRNA的转录和蛋白表达。PCR扩增及测序结果表明成功构建了p RRL-CMV-ED慢病毒表达载体,PCR扩增的目的基因大小为2 700bp左右;转染p RRL-CMV-ED的293T细胞上清经镍柱亲和纯化,SDS-PAGE分析纯化产物在105kD处有明显蛋白条带;Western及ELISA结果显示,纯化蛋白为C-Met胞外区蛋白且能与肝细胞生长因子(HGF)特异性结合。本研究结果可能为制备C-Met单克隆抗体以及筛选阻断HGF/C-Met信号通路的中和抗体奠定基础。; 郭佳尹衍新蒋明于丽华蒋韵李贵情房健民; 关键词：慢病毒表达载体

抗间质上皮转化因子(c-Met)单价抗体的制备及生物学活性检测: 2016年; 目的用抗人间质上皮转化因子(c-Met)阻断型嵌合抗体ch3E1D7表达质粒构建单价抗体慢病毒穿梭质粒,利用慢病毒表达系统实现其在HEK293T细胞中快速表达,并对纯化后抗体的亲和力及中和活性进行检测。方法设计抗c-Met的单价抗体,命名为mono3E1D7,利用基因工程技术构建单价抗体三条链的慢病毒表达载体,磷酸钙法转染HEK293T细胞,表达的单价抗体经蛋白A琼脂糖4B亲和层析柱纯化,SDS-PAGE检测抗体完整性,ELISA检测单价抗体在体外阻断c-Met与其配体HGF结合的生物学活性。结果感染单价抗体慢病毒的HEK293T细胞上清纯化后,SDS-PAGE分析可见55 ku的重链、25 ku的轻链以及30 ku的杵状结构链(Knob)三条带。且纯化后的单价抗体能与c-Met抗原结合,同时还具有阻断c-Met与HGF结合的中和活性。结论成功获得抗人c-Met阻断型单价抗体。; 郭佳蒋明靳令经尹衍新孙慧于丽华毛玉婷房健民; 关键词：C-MET 嵌合抗体慢病毒表达

抗人肝细胞生长因子受体单链抗体慢病毒载体的构建和应用被引量：3: 2014年; 目的构建可表达抗人肝细胞生长因子受体(HGFR)单链抗体(scFv)的慢病毒表达载体,将其感染HEK293细胞,检测该抗体的表达及与抗原结合活性。方法采用反转录PCR(RT-PCR)从分泌小鼠抗人HGFR抗体的杂交瘤细胞株(8E8)中扩增VH和VL基因,用重叠延伸PCR法将VH和VL进行拼接,得到含有信号肽SP-VH-linker-VL的单链抗体基因(HGFR-scFv),将其插入克隆载体pCR-Blunt中。用内切酶将HGFR-scFv基因从pCR-Blunt上切下,插入慢病毒载体pRRL-CMV中,经相应酶切和测序鉴定,正确构建慢病毒表达载体pRRL HGFR-scFv。磷酸钙法转染HEK293T细胞,48 h后通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,将获得病毒颗粒进一步感染HEK293细胞,RT-PCR和ELISA检测scFv的表达情况。结果抗人HGFRscFv的慢病毒表达载体构建成功,病毒颗粒感染HEK293细胞后,得到了可以稳定表达抗人HGFR-scFv的细胞系;ELISA结果表明,scFv能与人HGFR特异性结合。结论成功克隆了小鼠抗人HGFR抗体的scFv基因,并构建其慢病毒表达系统。; 陈永华郭佳尹衍新蒋明朱红胜张国栋李冰宇; 关键词：肝细胞生长因子受体单链抗体慢病毒表达载体

空肠弯曲菌脉冲场凝胶电泳分子检测方法的建立及应用被引量：9: 2009年; 【目的】建立空肠弯曲菌脉冲场电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)图谱分型方法。【方法】在PFGE基本程序基础上,通过调整菌液浓度、Seakem Gold琼脂糖凝胶浓度、蛋白酶K浓度、洗涤方式和限制性内切酶SmaⅠ浓度,进行程序的比较与优化。应用PFGE技术对不同来源分离株进行分析。【结果】37株空肠弯曲菌脉冲场凝胶电泳图谱显示分离株均产生了6～24条电泳带,条带数量适中,清晰易读;系统进化树显示,可分为4个遗传谱系,分离株主要分布于PFGE遗传谱系Ⅳ,不同源分离株在各组群中呈交叉分布。【结论】PFGE对空肠弯曲菌具有很强的分型能力和良好的溯源性,初步数据显示鸡、牛等动物源空肠弯曲菌与腹泻病人空肠弯曲菌病密切相关。; 黄金林许海燕姜丰尹衍新张弓潘志明刘秀梵焦新安; 关键词：空肠弯曲菌脉冲场凝胶电泳分子分型

空肠弯曲菌FlaA单克隆抗体的制备与鉴定被引量：2: 2010年; 【目的】原核表达空肠弯曲菌鞭毛蛋白FlaA,并制备其单克隆抗体。【方法】克隆目的基因并将其构建到pET30a(+)和pGEX-6p-1表达载体,分别以变复性纯化后的rHis-FlaA、rGST-FlaA蛋白为免疫原和检测原进行杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法测定细胞上清和单抗腹水效价,Dot-ELISA、Western blot分析单抗特异性。【结果】成功构建pET30a(+)-flaA和pGEX-6p-1-flaA重组原核表达质粒,并融合表达rHis-FlaA和rGST-FlaA蛋白,Western blot试验显示天然蛋白多抗血清能与体外表达的蛋白呈现特异性反应,表明表达蛋白具有免疫原性。筛选获得3株稳定分泌抗FlaA的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为2D12、5E12、6A9,其Ig亚类分别为IgG2a、IgG1、IgG1,腹水效价分别为1∶102400,1∶102400和1∶51200;Western blot试验显示,3株单抗均能与表达rHis-FlaA重组蛋白的细菌发生特异性反应;Dot-ELISA试验表明,3株单抗均能与不同来源的空肠弯曲菌分离株发生特异性反应。【结论】本研究制备的单克隆抗体有较高特异性,具有良好的应用价值。为进一步研究空肠弯曲菌鞭毛蛋白的生物学特性、致病机理,以及建立快速检测技术奠定基础。; 黄金林尹衍新梅德霞张弓潘志明刘秀梵焦新安; 关键词：空肠弯曲菌单克隆抗体

空肠弯曲菌cjaA基因表达蛋白单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定被引量：1: 2011年; 目的:原核表达空肠弯曲菌CjaA蛋白,并制备其单克隆抗体(mAb)。方法:克隆目的基因并将其构建到pGEX-6p-1和pET30a(+)表达载体,分别以变复性纯化后的rGST-cjaA、rHis-cjaA蛋白为免疫原和检测原进行杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法测定细胞上清和mAb腹水效价,Dot-ELISA、Western blot分析mAb特异性。结果:成功构建pET30a(+)-cjaA和pGEX-6p-1-cjaA重组原核表达质粒,并融合表达rHis-cjaA和rGST-cjaA蛋白,Western blot试验显示全菌多抗血清能与体外表达的蛋白呈现特异性反应,表明表达蛋白具有免疫原性。筛选获得3株稳定分泌抗CjaA的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为2B6、3C2、4F11,其Ig亚类均为IgG1,腹水效价分别为1∶1×105、1∶2×105和1∶4×105;Western blot试验显示,3株mAb均能与表达rHis-CjaA重组蛋白的细菌发生特异性反应;Dot-ELISA试验表明,3株mAb均能与不同来源的空肠弯曲菌分离株发生特异性反应。结论:本研究制备的mAb有较高特异性,具有良好的应用价值。为进一步研究空肠弯曲菌CjaA蛋白的生物学特性、致病机制,以及建立快速检测技术奠定基础。; 黄金林尹衍新胡元庆张弓刘秀梵焦新安; 关键词：空肠弯曲菌单克隆抗体

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尹衍新

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