潘永飞
- 作品数：13 被引量：30H指数：4
- 供职机构：华中农业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金霍英东青年教师基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 重组杆状病毒作为一种新型的基因治疗载体的研究
- 长期以来，由于其宿主特异性，杆状病毒载体仅限于在昆虫细胞内表达外源蛋白。但最近的研究发现，携带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能有效转导哺乳动物细胞并且可以在哺乳动物细胞中高效表达外源蛋白。由于其转导效率高、易操作、增殖滴度...
- 潘永飞
- 关键词：基因治疗重组杆状病毒凋亡素基因肌营养不良
- 文献传递
- 一种重组杆状病毒载体骨架质粒及其应用
- 本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种重组杆状病毒载体骨架质粒的构建及应用。本发明克隆得到一种重组杆状病毒转移载体骨架质粒pFB－G－SFV，该质粒保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC N...
- 肖少波方六荣赵骞江云波潘永飞
- 文献传递
- 伪狂犬病病毒PK基因的克隆与PK、gG双缺失转移载体的构建被引量：6
- 2006年
- 地高辛标记伪狂犬病病毒(PRV)E a株短区段蛋白激酶(PK)基因3′端0.4 kb片段,Sou thern杂交确定短区段PK基因定位在基因组DNA B amHⅠ4.0 kb片段中。将该片段克隆获得重组质粒pSB 304,对pSB 304亚克隆,构建了仅含完整PK基因约1.3 kb片段的重组质粒pSB 305,并进行了序列测定。结果表明,PK基因存在2种可能的同框编码方式,分别编码388或334个氨基酸残基,并具有真核细胞蛋白激酶催化结构域序列。同国外PRV N IA-3、K a株相比,氨基酸同源性分别为98.8%和97.3%,有意义的是E a株、K a株均较N IA-3株在同一位置缺失2个氨基酸(A sp,G ly)。进一步对pSB 305和含gG全基因以及部分gD基因的质粒pU SK进行酶切拼接,将PK基因大部分编码区、gG基因5′端部分编码区进行缺失,构建成两端同源侧翼分别为3.1 kb和1.6 kb的PK、gG双缺失转移载体pLR 001。上述结果为深入研究PK基因功能及研制更安全的TK-/PK-/gG-三缺失基因工程疫苗奠定了基础。
- 方六荣肖少波姚林潘永飞谢京国陈焕春
- 关键词：伪狂犬病病毒
- 猪白细胞介素15基因的克隆及在大肠杆菌中的表达被引量：3
- 2007年
- 本研究通过RT-PCR方法从用ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪IL-15(pIL-15)编码序列的cD-NA,将其克隆至T载体pMD18-T后,序列测定表明pIL-15基因长度为489 bp,编码162个氨基酸。进一步通过PCR方法获得缺失其N端48 aa的信号肽序列的成熟pIL-15蛋白基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-28a的6×His下游,构建重组表达质粒pET-pIL15,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,重组菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到分子量约为15 ku的重组蛋白,其表达量占总菌体蛋白量的17.5%。Western blot试验也证实表达的重组融合蛋白6×His-pIL15能够很好地与抗6×His单抗发生反应。猪IL-15基因的克隆、表达为进一步研究其功能和应用奠定了基础。
- 江云波方六荣肖少波张辉潘永飞罗锐李彬陈焕春
- 关键词：基因克隆原核表达
- 人单纯疱疹病毒1型VP22介导的microdystrophin重组腺病毒的构建及其蛋白转导特性被引量：2
- 2008年
- 目的构建含有人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)VP22与人microdystrophin基因融合的重组腺病毒,体外感染成肌细胞C2C12,探讨VP22对microdystrophin基因在成肌细胞中的蛋白转导特性。方法设计引物,从质粒pSIN-rep5-VP22中扩增VP22全长基因,然后将VP22基因定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pCMV-VP22;再用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-micro质粒,获得microdystrophin基因,片段回收后定向插入重组质粒pCMV-VP22,获得重组质粒pCMV-VP22-MICDYS。PmeI线性化重组质粒pCMV-VP22-MICDYS,去磷酸化后回收与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组腺病毒。将含VP22-microdystrophin及microdystrophin的病毒上清分别转染成肌细胞C2C12,通过RT-PCR、Western-blot和免疫组织化学方法检测microdys-trophin的mRNA及蛋白表达。结果成功构建了含有VP22-microdystrophin基因的重组腺病毒,体外感染成肌细胞C2C12,Western-blot及免疫组织化学检测显示VP22显著提高了microdystrophin蛋白在C2C12细胞中的表达。结论含有VP22-microdystrophin基因的重组腺病毒载体的构建及VP22介导microdystrophin在成肌细胞C2C12间的转导,为利用此病毒进行假肥大型肌营养不良症疾病的治疗研究奠定了基础。
- 熊符张成郑卉肖少波潘永飞许勇峰刘正山李勇
- 关键词：腺病毒假肥大型肌营养不良症
- 共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5和M蛋白增强DNA疫苗免疫应答的研究被引量：5
- 2007年
- 为了增强猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗免疫效力,分别以PRRSV ORF5m(修饰型ORF5基因)及ORF6为候选基因,构建了单基因或双基因共表达的真核表达质粒pCI-ORF5m、pCI-ORF6及pCI-ORF5m/ORF6。转染BHK-21细胞,Western blot检测证实ORF5m和ORF6基因均获得正确表达,并且共表达的GP5m和M蛋白能够形成异源二聚体。将构建的表达质粒免疫小鼠,首免后6周共表达ORF5m和ORF6基因的pCI-ORF5m/ORF6免疫组小鼠血清中和抗体全部阳转,8周时最高可达到1:32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答,明显高于单独表达ORF5m基因的pCI-ORF5m免疫组。进一步将DNA疫苗免疫断奶仔猪,pCI-ORF5m/ORF6免疫组同样能诱发优于pCI-ORF5m免疫组的中和抗体和细胞免疫反应。上述研究结果表明采用ORF5m和ORF6双基因共表达策略能够显著提高PRRSV DNA疫苗效力,为PRRSV新型疫苗的研制提供了有用的数据。
- 江云波肖少波方六荣潘永飞罗锐陈焕春
- 关键词：ORF6双基因共表达
- 与α疱疹病毒VP22蛋白融合增强“自杀性”DNA疫苗的免疫反应被引量：8
- 2006年
- α疱疹病毒VP22具有独特的蛋白转导特性,能通过一种不依赖于高尔基体的非经典途径从原始表达细胞转导到邻近的非表达细胞中,而且VP22还能使与之融合的外源蛋白在细胞间转导.因此,VP22是一种极具开发潜力的免疫增强分子.本研究以牛疱疹病毒1型(BHV-1)的VP22为研究对象,以β-半乳糖苷酶(β-gal)为模式抗原,构建了BHV-1VP22(BVP22)与β-gal融合的“自杀性”DNA疫苗表达质粒pSCAB-gal,转染BHK-21细胞.X-gal染色结果表明,表达的融合蛋白BVP22-gal仍具有蛋白转导能力,而单独表达β-gal的“自杀性”DNA疫苗表达质粒pSCA-gal不具有这种能力.进一步将pSCAB-gal和pSCA-gal分别免疫BALB/c小鼠,结果pSCAB-gal免疫能显著增强β-gal特异性ELISA抗体和细胞毒T细胞(CTL)活性,表明与BVP22融合能显著增强“自杀性”DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫反应.
- 肖少波方六荣姚琳潘永飞江云波陈焕春
- 关键词：蛋白转导
- 双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗载体的改造及其体外表达特性被引量：2
- 2006年
- PCR扩增西门利克森林病毒(SFV)亚基因组启动子26S序列及人工合成Linker,将其插入基于SFV复制子的“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA1的多克隆位点,获得含2个26S启动子并能同时驱动双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗表达载体pSCA2。为了验证pSCA2的表达能力,PCR扩增绿色荧光蛋白基因EGFP和红色荧光蛋白基因DsRed2,分别插入pSCA2的2个26s启动子下游,获得EGFP和DsRed2双基因共表达的“自杀性”DNA疫苗pSCA2-EGFP/RFP。将pSCA2-EGFP/RFP转染BHK-21细胞,转染后24h,可同时观察到被转染细胞发绿色荧光和红色荧光,证实EGFP和DsRed2均获得表达。
- 谢京国方六荣肖少波姚林潘永飞陈焕春
- 关键词：双基因共表达
- 基于西门利克森林病毒复制子的“自杀性”DNA疫苗载体的构建及其体外表达特性被引量：5
- 2005年
- 对西门利克森林病毒(SFV)复制子质粒型表达载体pSFV1进行改造,即在SFV非结构蛋白(nSPs) 上游插入依赖于RNA聚合酶Ⅱ的人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子序列(hCMV IE Pro/Enh),同时在pS- FV1的多克隆位点下游插入SV40 poly(A)终止信号序列,获得可以完全在DNA水平上操作并具有自主复制功能的表达载体pSFV-DNA。为了进一步探讨改造载体的转染效率、表达能力以及是否能诱导细胞凋亡等特性, 将报告基因EGFP插入pSFV-DNA中亚基因组启动子下游,构建的重组表达质粒pSFV-EGFP转染BHK-21 细胞,转染后12 h即可观察到荧光,但转染效率明显低于直接由hCMV IE Pro/Enh驱动的EGFP真核表达质粒pEGFP-C1;提取转染后48 h的细胞基因组DNA,电泳发现pSFV-EGFP转染细胞均呈典型的DNA断裂(ladder),而pEGFP-C1转染细胞未观察到这种现象。上述结果表明:改造的载体不仅可完全在DNA水平上操作,而且能正确表达外源基因和诱导细胞凋亡,为开展各种病原微生物的“自杀性”DNA疫苗研究提供了良好的工具。
- 方六荣肖少波谢京国潘永飞姚林陈焕春
- HSV-1 VP22及microdystrophin基因融合表达重组质粒的构建及其生物学特性的初步研究
- 2009年
- 目的构建人单纯疱疹病毒1型（HSV-1）病毒蛋白22（VP22）及microdystrophin基因融合表达重组质粒，体外研究其表达及HSV-1 VP22介导的蛋白转导特性，为进一步利用此重组质粒治疗Duchenne型肌营养不良症（DMD）奠定基础。方法从质粒pSINrep5-VP22中PCR扩增HSV-1 VP22全长基因，然后克隆至真核表达载体pAVX1中，构建重组质粒pAVP22；再用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒，获得microdystrophin基因，片段回收后定向插入质粒pAVP22中，获得重组质粒pAVP22-MICDYS；然后将重组质粒pAVP2-MICDYS转染至小鼠成纤维细胞3T3细胞，通过RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光检测microdystrophin基因的转录及蛋白表达；最后收集转染后3T3细胞上清。感染人间充质干细胞（MSCs），检测重组蛋白在人MSCs中的表达情况来分析HSV-1 VP22是否可以介导VP22-microdystrophin融合蛋白的转导。结果成功构建了含有HSV-1 VP22和microdystrophin基因的重组质粒，并在体外得到了很好表达；同时也证实HSV-1 VP22提高了microdystrophin基因在3T3细胞中的表达效率。并可介导VP22-microdystrophin蛋白从3T3细胞到人MSCs间的转导。结论该重组质粒的构建及体外成功表达和蛋白转导特性的确定为下一步用该重组质粒进行DMD疾病治疗研究奠定了基础。
- 熊符张成陈松林郑卉肖少波潘永飞于美娟冯善伟卢锡林
- 关键词：蛋白转导
