高正勇
- 作品数：13 被引量：119H指数：5
- 供职机构：中国水产科学研究院长江水产研究所更多>>
- 发文基金：公益性行业(农业)科研专项中央级公益性科研院所基本科研业务费专项中国水产科学研究院基本科研业务费专项基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：28
- 2012年
- 利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp的片段,克隆到pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后,以10倍梯度稀释pMD19-T-MCP重组质粒,作为标准模板进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增,制作标准曲线,建立了大鲵虹彩病毒的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示,该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性,与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应,特异性好,检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数,约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸,较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。
- 周勇曾令兵孟彦周群兰张辉高正勇肖艺孙建滨
- 关键词：虹彩病毒
- 嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫后大鲵外周血免疫指标的变化研究
- 以福尔马林灭活的嗜水气单胞(Aeromonas hydrophila)作为免疫原(F-AH),通过腹腔注射免疫健康大鲵,剂量为0.5ml/尾,分别免疫后的第1、4、7、14、21、28天采集血液样品,进行大鲵外周血液的血...
- 杨星曾令兵刘文枝肖汉兵孟彦高正勇张辉
- 关键词：嗜水气单胞菌灭活疫苗吞噬活性
- 文献传递
- 大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用
- 本发明公开了一种大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用，其步骤是：1)根据GSIV-MCP基因序列，设计引物；2)用EPC细胞培养GSIV，抽提病毒核酸为模板，PCR扩增；3)将纯化的PCR产物插入到PET-3...
- 曾令兵高正勇张辉周勇孟彦
- 文献传递
- 嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫后大鲵外周血免疫指标的变化研究
- 以福尔马林灭活的嗜水气单胞(Aeromonas hydrophila)作为免疫原(F-AH)，通过腹腔注射免疫健康大鲵，剂量为0.5ml/尾，分别免疫后的第1、4、7、14、21、28天采集血液样品，进行大鲵外周血液的血...
- 杨星曾令兵刘文枝肖汉兵孟彦高正勇张辉
- 关键词：嗜水气单胞菌灭活疫苗吞噬活性
- 草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法的建立被引量：15
- 2013年
- 根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)等无交叉反应。该方法灵敏度及特异性高,且不需昂贵仪器设备,为快速检测草鱼呼肠孤病毒与诊断草鱼出血病提供了简捷快速的技术手段。
- 张金凤曾令兵张辉周勇肖艺苏岚高正勇
- 关键词：草鱼出血病呼肠孤病毒
- 大鲵虹彩病毒理化及生物学特性研究被引量：30
- 2012年
- 对大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)的理化特性及生物学特性进行了研究。结果表明:GSIV对热处理敏感,56℃和65℃处理30 min均可彻底灭活病毒;GSIV经酸(pH3)和碱(pH10)处理,病毒滴度(TCID50)与对照组相比较分别下降了8.58、9.04个对数级,差异极显著(P<0.01);GSIV经有机溶剂氯仿、乙醚以及胰蛋白酶处理,TCID50与对照组相比较分别下降了9.33、7.83、6.49个对数级,差异极显著(P<0.01)。冻融次数对GSIV滴度的影响不显著(P>0.05)。GSIV对细胞培养物的感染性试验结果表明,GSIV可在鲤上皮瘤细胞系(Epithelioma papilloma cyprini,EPC)、斑点叉尾鮰肾脏细胞系(Channel catfish kidney,CCK)、虹鳟鱼性腺细胞系(Rainbow trout gonadal,RTG-2)等细胞中增殖,但在EPC、CCK细胞中增殖速度快,TCID50高;GSIV在EPC细胞中的最适生长温度是25℃。GSIV在EPC细胞中增殖动态试验结果表明,GSIV感染细胞6 h后TCID50开始快速上升,进入对数增长期,72 h时TCID50达到最大值,以后趋于稳定。GSIV感染EPC细胞超薄切片透射电镜观察结果显示,在EPC细胞质中可见大量虹彩病毒样颗粒,呈晶格状排列,直径约140 nm。
- 高正勇曾令兵肖汉兵张辉孟彦肖艺徐进
- 关键词：理化特性生物学特性
- 大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗及制备方法和应用
- 本发明公开了一种大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗及制备方法和应用，其步骤：A．EPC细胞复苏；B．EPC细胞培养，用于扩增大鲵虹彩病毒；C．GSIV病毒扩增：待EPC传代细胞在瓶底铺满时，加入感染的病毒悬液；D．GSIV...
- 曾令兵肖汉兵孟彦马杰肖艺周勇高正勇孙建滨
- 文献传递
- 草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白在毕赤酵母中表达的初步研究被引量：3
- 2012年
- 根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,结果表明成功实现了GCRV-104 VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达,重组VP6蛋白相对分子质量约46 000,与天然VP6蛋白相对分子质量接近,并且可与鼠抗草鱼GCRV-104 VP6蛋白的多克隆抗体特异性结合。
- 苏岚曾令兵周勇张辉高正勇张金凤
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒
- 患病大鲵中弗氏柠檬酸杆菌的分离与鉴定被引量：42
- 2012年
- 【目的】确定导致大鲵(Andrias davidianus)细菌性感染死亡的病原。【方法】从大鲵肝脏中分离细菌,通过Biolog微生物自动鉴定系统及分子生物学方法对纯培养的细菌进行鉴定,再用大鲵和鲫鱼分别进行人工感染试验,以确定分离菌的致病性,同时对分离到的病原菌进行药物敏感试验。【结果】从患病大鲵肝脏中分离到一株致病菌JZ01,经人工感染健康大鲵,可复制与自然发病相同的症状,且从人工感染病鲵体内再次分离到相同的病原菌。该致病菌对健康鲫鱼也有致病性。经Biolog微生物自动鉴定系统的鉴定,以及进一步的16S rDNA基因序列和系统发育分析都表明,此致病菌为弗氏柠檬酸杆菌。药物敏感性试验表明,该菌株对氨曲南、头孢三嗪、先锋噻肟等9种药物高度敏感。【结论】弗氏柠檬酸杆菌是大鲵的一种致病菌。本文在国内外首次报道了该菌对大鲵具有致病性。
- 高正勇曾令兵孟彦刘小玲张波
- 关键词：药敏试验
- 嗜水气单胞菌3种疫苗免疫的青鱼外周血免疫指标的变化被引量：15
- 2012年
- 将福尔马林灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、菌体外膜蛋白(OMP)和菌体脂多糖(LPS)作为免疫原,分别免疫健康青鱼。在免疫1、2、4、7、14、21、28d后进行外周血的血细胞计数和白细胞分类计数,测定细胞吞噬活性和抗体效价,结果表明:3种免疫原均可诱导红细胞和白细胞数量增加,并引起各种白细胞分类百分比变化,提高吞噬活性和抗体效价;免疫应答早期(第1周)主要是红细胞、单核细胞和中性粒细胞数量明显增加,吞噬细胞的吞噬活性迅速提高,吞噬百分比(PP)和吞噬指数(PI)第4天达峰值,F-AH组、OMP组和LPS组的PP、PI值依次分别为39.84%、46.53%、41.59%及3.94、4.26、3.77;随后则是淋巴细胞大量增殖,第21天淋巴细胞数量和抗体效价达峰值,F-AH组、OMP组和LPS组的抗体效价分别为1∶426.67、1∶341.33和1∶213.33。免疫28d后活菌攻毒的结果表明,OMP组的免疫保护率为75%;LPS组为67.8%,均明显优于F-AH组(50%)。可见3种免疫原均能通过促进青鱼血细胞增殖、提高吞噬细胞的吞噬活性、产生特异性抗体等方式增强机体的免疫保护力。
- 张波曾令兵罗晓松高正勇周勇安伟
- 关键词：青鱼嗜水气单胞菌外膜蛋白吞噬活性
